長鏈非編碼RNA loc728196促進膠質瘤發生的調控機制

王歐洋

神經膠質瘤起源于中樞神經體系，發病率高，占原發性腦腫瘤35.26%～60.96%［1］，病理上多呈浸潤性生長，手術難度大，較難分辨出真正的腫瘤邊界，放療輻射耐受程度可能會引起殘余病灶復發。長鏈非編碼RNA（long non coding RNA，lncRNA）是一類轉錄本長度＞200核苷酸的RNA，本身無蛋白質編碼能力，近年來國內外研究表明，lncRNA參與中樞神經系統的表達，已有研究表明lncRNA在膠質瘤中存在異常表達［2］；lncRNA UCA1促進膠質瘤的生長，且可通過靶向miR-122發生轉移［3］。lncRNA CCAT1在抑制細胞凋亡的同時抑制miR-410，促進膠質瘤細胞的增殖。lncRNA SNHG1通過調節、遷移和凋亡促進膠質瘤的發展，可評估預后程度［4］。lncRNA TP73-AS1與miR-142相互作用，促進膠質瘤細胞的增殖。loc728196是一種新型lncRNA，但目前國內外尚無關于lncRNA loc728196與人腦膠質瘤的相關性研究。因此，本研究將實驗證明lncRNA loc728196/miR-513c軸通過靶向TCF7促進膠質瘤的發生。

1 材料與方法

1.1 細胞系及細胞培養 四種膠質瘤細胞系（U87、U251、LN229和A172）和人星形膠質細胞系（NHA）購自美國ATCC（American Type Culture Collection）。細胞培養在含有10%FBS的DMEM培養基中，且在37℃和5% CO2條件下培養。

1.2 細胞轉染 小干擾RNA（si-LOC728196；5"-G AGACU AUAUUGUUAGUAAUA-3"）和短發夾狀RNA （shRNA；5"-GAGACTATATTGTTAGTAATA-3"）由Invitrogen合成純化。MiR-513c模擬物（5"-UUCUCAAGGAGGUGUCGUUUAU-3"），MiR-513c抑制劑（5"-AUAAACGACACCUCCUUGAGAA-3"）和陰性對照組（miR-NC；5"-UCACAACCUCCUAGAAA GAGUAGA-3"）均購于 GenePharma公司（Shanghai，China）。參照轉染試劑 Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA） 的 說 明 書 步 驟， 將100nM siRNAs、miRNAs轉染至細胞系中。在病毒生產方面，將sh-LOC728196序列克隆到pHBLV-U6慢病毒核心載體中（Hanbio，Shanghai，China）。

1.3 細胞增殖實驗 2×103U251和A172細胞置于96孔板中培養24h、48h或72h。然后將CCK-8溶液（Beyotime，Shanghai，China） 加 入 細 胞 4h， 然后CCK-8法450nm波長處測定每組細胞吸光度值。1×103U251和A172細胞接種至6孔板的每一口中，孵育14d后，菌落用甲醛固定，用0.5%結晶紫（Sigma，USA）染色，然后用顯微鏡計數。

1.4 Transwell細胞遷移、侵襲實驗 細胞遷移實驗：將細胞組常規消化后，加入無血清的DMEM培養基制備1×108/L的細胞懸液。于24孔板Transwell小室上室中加入200μl細胞懸液，下室中加入含10% 胎牛血清的DMEM培養基。每組實驗重復3次。置于培養箱內常規培養48h后，取出小室，分別加入10%甲醇和0.1%結晶紫溶液固定、染色，晾干后，于倒置顯微鏡下觀察、拍照。各組細胞遷移能力以隨機選取的6個視野的細胞數的平均值表示。細胞侵襲實驗：實驗前，以濃度為1g/L的Matrigel對Transwell小室上室聚碳酸酯微孔膜進行包被，于培養箱內聚合反應30min后，在小室上室中加入細胞懸液，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，培養48h，取出小室，以甲醇和結晶紫對細胞進行固定和染色，倒置顯微鏡下拍照分析。詳細步驟參照遷移實驗。

1.5 qRT-PCR法 檢 測lncRNA-LOC728196、MiR-513c及TCF-mRNA表達 按照Trizol試劑盒步驟提取組織總RNA，以β-actin為內參，qRT-PCR按照SYBR-Green試劑盒說明進行反應體系的配置，通過PrimeScriptTMRT試劑盒檢測RNA濃度，反轉錄試劑盒合成cDNA。將逆轉錄的產物稀釋后，加相應RNA的引物，用SYBR Green Kit法進行擴增反應。以U6為內參，采用2-△△ct法計算目的基因的相對表達。

1.6 Western-blot法檢測TCF7蛋白表達 收集轉染48h后的各組細胞，加蛋白酶抑制劑裂解，4℃以下以12000r/min離心30min，取上清液，根據BCA蛋白定量檢測試劑盒操作要求測定總蛋白濃度。各組加入12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜；含5%脫脂牛奶的封閉液室溫下封閉1h，轉膜，加一抗，4℃過夜，加入二抗，室溫下孵育30min；洗模后顯影曝光。使用GAPDH為內參，ImageJ分析條帶灰度值。

1.7 統計分析 采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lnc RNA -loc728196在膠質瘤組織中存在高表達 實驗比較四種膠質瘤細胞系（U87、U251、LN229和A172）和人星形膠質細胞系（NHA）中lncRNA-loc728196基因表達差異，結果顯示膠質瘤細胞系中lncRNA-loc728196表達水平顯著高于正常膠質細胞系（見圖1）。結果表明lncRNA-loc728196與膠質瘤疾病的發生有密切相關性。

圖1 四種膠質瘤細胞系（U87、U251、LN229和A172）和NHA中lncRNA- loc728196基因表達比較（?P＜0.05，??P＜0.01）

2.2 loc728196影響膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲 對于loc728196的功能研究，作者進行了細胞增殖、遷移、侵襲實驗，首先設計了兩個針對loc728196抑制其表達的siRNA序列。qRT-PCR分析顯示，轉染兩種siRNA均可顯著抑制U251和A172細胞中loc728196的表達（見圖 2A）。然后，利用siRNA #1進行以下實驗。CCK8結果表明，沉默loc728196可降低U251和A172細胞的增殖率（見圖2B、C）。此外，克隆形成實驗還顯示，沉默loc728196可減少克隆數（見圖2D），表明loc728196能促進膠質瘤細胞的增殖。細胞遷移和侵襲實驗表明，沉默loc728196可抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲（見圖2E、F）。

圖2 U251、A172細胞株轉染不同干擾質粒后loc728196基因表達及細胞功能變化（?P＜ 0.05，??P＜0.01，???P＜0.001）

2.3 膠質瘤細胞中loc728196與 miR-513c的相互調節作用 在前期的生物信息學分析中，發現loc728196與miR-513c之間存在2個潛在結合位點（見圖3A）。基于此，作者在細胞系中轉染miR-513c模擬劑，結果顯示loc728196-WT#1和loc728196-WT#2的熒光素酶活性均被明顯抑制（見圖3B），表明轉染miR-513c可抑制loc728196表達水平。為了更進一步證明loc728196和miR-513c之間的調節關系，U251和A172細胞系通過慢病毒包裝轉染敲除loc728196，發現miR-513c表達水平較前提高（見圖3C）；在細胞中轉染miR-513c后，loc728196表達水平下降（見圖3D）。

2.4 LOC728196通過miR-513c調控TCF7表達 前期生物信息學分析中，作者已經發現miR-513c與TCF7 mRNA結合的2個潛在位點（見圖4A）。熒光素酶實驗結果也證明了miR-513c可結合在 TCF7 mRNA的3 "-UTR區域的兩個位點（見圖4B）。U251和A172細胞中轉染miR-513c后，TCF7蛋白水平和mRNA水平均下降（見圖4C、D）；同時轉染miR-513c和loc728196-WT的細胞組TCF7 mRNA水平較轉染miR-513c細胞組明顯升高（見圖4F）。在U251和A172細胞中轉染si-loc728196，TCF7 mRNA水平下降；而同時轉染si-loc728196和miR-513c抑制劑的細胞組TCF7 mRNA水平明顯高于僅轉染si-loc728196細胞組（見圖4E）。以上結果表明loc728196可通過抑制miR-513c發揮促進TCF7表達的作用。

圖3 loc728196與miR-513c的熒光素酶活性結果及miR-513c對loc728196的負調控作用（?P＜0.05，??P＜0.01，???P＜0.001）

圖4 TCF7與miR-513c的熒光素酶活性結果及miR-513c、loc728196對TCF7的調節作用（?P＜0.05，??P＜0.01，???P＜0.001）

3 討論

lncRNA很多功能尚未完全明確［5］，但隨著基因組技術的發展，越來越多的證據表明lncRNA通過調控靶基因表達，參與多方面的細胞生物功能，包括轉錄的激活、轉錄后調控等［6］。lnc RNA很可能影響促癌基因或抑癌基因的功能，從而促進或者抑制腫瘤的形成［7］。近年來國內外研究表明，lncRNA HNRNPKP2在胃癌中表達上調，其通過CXCR4的表達促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲［8］；也有研究表明，lncRNA SNHG1作為一種ce RNA 抑制miR-199a-3p活性，刺激CDK7的表達，因此促進前列腺癌細胞的增殖和細胞周期的發展［9］；此外，lncRNA MALAT1通過調節miR-125b在口腔鱗狀細胞癌中發揮癌基因的作用［10］；lncRNA HOXD-AS1通過作為 ceRNA 上調 SOX4水平促進肝癌轉移。不僅如此，現有研究表明越來越多lncRNA參與中樞神經系統的表達，國內外研究也證明lncRNA在膠質瘤中存在異常表達［11］。已有研究表明，lncRNA UCA1促進膠質瘤的生長，且可通過靶向 miR-122發生轉移［12］；lncRNA CCAT1在抑制細胞凋亡的同時抑制miR-410，促進膠質瘤細胞的增殖［13］；lncRNA SNHG1通過調節、遷移和凋亡促進膠質瘤的發展，可評估預后程度［14］；lncRNA TP73-AS1與miR-142相互作用，促進膠質瘤細胞的增殖［15］；lncRNA MALAT1可增強膠質瘤細胞對替莫唑胺的耐藥性［16］。此外，lncRNA CRNDE 可作為評估膠質瘤預后的生物標記物［17］。以上諸多研究均表明lncRNA可能在膠質瘤生長及凋亡等過程中起到關鍵調控作用。本研究表明沉默loc728196可抑制膠質瘤細胞的生長，提示lncRNA loc728196可能與膠質瘤細胞生長和凋亡密切相關；同時作者也發現loc728196可能作為一個ceRNA 調節miR-513c的表達，而TCF7可能是miR-513c的直接靶標，且loc728196和miR-513c之間存在相互抑制關系，loc728196通過調節miR-513c促進TCF7表達，因此，作者推測lncRNA loc728196可能通過miR-513c/TCF7途徑來參與對膠質瘤的生長及凋亡的調控。本研究通過研究膠質瘤惡性生物學行為密切相關的分子生物學靶點，尋求一種新的生物學標志物，及早發現及阻斷膠質瘤的生長和增殖，從新的角度揭示lncRNA loc728196可能通過miR-513c/TCF7途徑調控膠質瘤的生長及凋亡，為膠質瘤患者的治療及預后評估提供了新的治療靶點。