口腔鱗狀細胞癌中NFATc2的表達和定位

王元杰，彭宏峰，董 偉，梁永強，董 青，張瑾瑾，馬 冬

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是口腔科最常見的惡性腫瘤，其發病年輕化、預后差、復發風險高，5年生存率仍較低[1-3]，提示早期診斷十分重要。飲酒、嚼檳榔和吸煙是OSCC發生的主要因素[4]。本課題組前期研究發現[5]，受體型蛋白酪氨酸磷酸酶(receptor protein tyrosine phosphatase-K, PTPRK)的表達受DNA甲基化的影響并與OSCC相關，但是其表達下調所影響的下游分子仍不清楚。OSCC的發生、發展與炎癥相關[6-7]，已有報道炎癥可誘導活化T細胞核因子c2蛋白(nuclear factor of activated T cells c2, NFATc2)的表達和入核，進而通過調控炎癥相關因子的轉錄(如IL-6和IL-11等)促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[8]；在鼻型自然殺傷細胞/T細胞淋巴瘤中，PTPRK表達下調與NFATc2表達升高相關[9]，以及NFATc2通過上調原癌基因ETS1的表達促進乳腺癌細胞的侵襲[10]。盡管目前在口腔癌的遺傳多態性[11]和細胞水平上已有轉錄因子NFATc2方面的研究報道[12]，但是NFATc2與PTPRK的關系及其臨床意義的研究仍顯不足。因此，本實驗采用生物信息學預測、OSCC臨床樣本、人正常口腔上皮細胞系HIOEC和OSCC細胞系SCC25進行實驗，探討NFATc2在OSCC中的表達和作用，為OSCC的早期診斷和治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1一般資料 選取2013年1月～2015年6月華北理工大學附屬醫院口腔科收治的57例OSCC患者，均經病理診斷明確。其中男性34例，女性23例，年齡43～67歲，中位年齡(54.21±9.79)歲；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期19例、Ⅲ+Ⅳ期38例。另收集癌旁正常口腔黏膜組織標本41例作為對照組。兩組標本在采集完成后迅速用生理鹽水清洗血漬，并用4%多聚甲醛固定和石蠟組織包埋以及部分樣本進行液氮凍存。

1.1.2細胞系 人正常口腔上皮細胞系HIOEC和人OSCC細胞系SCC25，購自中國科學院上海細胞庫。采用含10%胎牛血清的DMEM培養基，并加鏈霉素(100 μg/mL)和青霉素(100 U/mL)，5%CO237 ℃培養。

1.2 方法

1.2.1生物信息學預測 DNA采用在線GeneMANIA網站預測與PTPRK關聯度高的基因(http://genemania.org/search/homo-sapiens/PTPRK/)。

1.2.2免疫組化 所有標本均經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚切片。免疫組化染色采用SP法，染色步驟嚴格按試劑說明書進行。隨機選取5個癌巢內的視野，通過Image-Pro Plus 6.0軟件(美國MEDIA CYBERNETIC圖像技術公司)分析棕色顆粒在整個視野內所占百分比。

1.2.3細胞免疫熒光染色 培養人正常口腔上皮細胞系HIOEC和OSCC細胞系SCC25細胞爬片，4%多聚甲醛固定8 min，0.5%Triton PBS通透2 min，10%山羊血清封閉，應用鼠單克隆抗體NFATc2(1 ∶50，sc-7296，Santa Cruz公司)稀釋液4 ℃孵育過夜，Fluorescein標記的抗兔二抗(anti-PTPRK，1 ∶100稀釋，紅色)室溫孵育45 min，DAPI染核，細胞核呈藍色。熒光顯微鏡下觀察人正常口腔上皮細胞系HIOEC和OSCC細胞系SCC25中NFATc2表達的熒光強度和核定位情況，采用Image Pro-Plus 6.0軟件定量分析NFATc2的表達水平。結果判定：NFATc2蛋白在OSCC中的表達水平高于配對對照組織中的表達定義為高表達；在OSCC組織中的表達低于配對對照組織的表達定義為低表達。

2 結果

2.1 OSCC組織中NFATc2的表達采用GeneMANIA網站在線預測與PTPRK基因表達在分子互作、共表達、共定位和分子通路等方面相關的基因結果顯示，PTPRK與NFATc2基因關聯度高，主要表現在分子通路關系(圖1)；采用免疫組化實驗進一步證實了預測結果，在OSCC組織中NFATc2表達顯著升高(P<0.01)，且其表達主要定位于細胞核(圖2)。

圖1 GeneMANIA網站預測與PTPRK基因表達相關的基因：圓圈大小代表關聯度大小，紅色線代表相互作用，藍色線代表分子通路

圖2 口腔鱗狀細胞癌和正常對照組織中NFATc2的表達：A. 免疫組化檢測NFATc2的表達，SP法；B. 柱狀圖顯示NFATc2的表達；與對照組相比，**P<0.01

2.2 OSCC組織中PTPRK與NFATc2表達的關系免疫組化檢測OSCC組織中PTPRK的表達，其中PTPRK高表達21例，低表達36例；并將PTPRK高表達和低表達OSCC組織樣本中的NFATc2陽性細胞數進行統計分析，在PTPRK高表達OSCC組織中NFATc2表達減少；相反，PTPRK低表達OSCC組織中NFATc2表達明顯升高[(14.8±3.2)%vs(55.9±4.4)%，P<0.01，圖3]。

圖3 口腔鱗狀細胞癌組織中PTPRK與NFATc2的表達：A. 免疫組化檢測，SP法；B. 柱狀圖顯示PTPRK與NFATc2的表達；與PTPRK高表達組相比，**P<0.01

2.3 NFATc2在人正常口腔上皮細胞系HIOEC和OSCC細胞系SCC25中的表達和定位采用免疫熒光染色證實NFATc2在人正常口腔上皮細胞系HIOEC和OSCC細胞系SCC25中的表達和定位，結果顯示在HIOEC中，NFATc2表達較少且定位于細胞質中，而在SCC25中其表達升高1.89倍(P<0.001)，且其表達核定位顯著增加，提示在OSCC中NFATc2表達明顯升高，且在細胞核中發揮生物學功能(圖4)。

圖4 人正常口腔上皮細胞系HIOEC和口腔鱗狀細胞癌細胞系SCC25中NFATc2的細胞免疫熒光染色結果：A. 紅色代表NFATc2染色結果，藍色代表DAPI細胞核染色結果； B. 柱狀圖顯示各細胞系中NFATc2的表達；與HIOEC相比，***P<0.001

2.4 NFATc2表達與OSCC臨床病理特征的關系OSCC中NFATc2表達與患者性別、年齡和淋巴結轉移無關(P均>0.05)；而與TNM分期和分化程度有關(P均<0.05，表1)。

表1 口腔鱗狀細胞癌中NFATc2表達與臨床病理特征的關系

3 討論

NFAT家族蛋白最初在活化的T細胞中作為IL2的轉錄激活蛋白而鑒定得到，包含一個高度保守的REL同源區域(REL-homology domain, RHD),與DNA結合來調控下游基因的轉錄，其不僅調控T細胞的發育和分化，而且還促進腫瘤細胞的生長、增殖、遷移、侵襲和新生血管形成[13-14]。目前已有報道NFATc2表達能夠促進胃癌[8]、肺癌[15]、黑色素瘤[16]、食管癌[17]和肉瘤[18]的發生、發展。

本組前期實驗發現[5]，PTPRK基因啟動子DNA高甲基化導致其表達減少在OSCC中具有重要臨床意義。本實驗通過生物信息學預測和OSCC臨床樣本及細胞系實驗驗證發現，PTPRK與NFATc2表達在分子通路上具有相反的關系，此結果與在胃癌和淋巴瘤中的研究結果一致。STAT3信號異常激活與OSCC的發生、發展密切相關[19]。Qi等[8]在表觀遺傳學變化促進胃癌進展的機制研究中發現，STAT3信號通過組蛋白H3的絲氨酸磷酸化異常激活絲裂原和應激激活蛋白1(mitogen-and stress-activated protein kinase 1, MSK1)表達，共同形成正反饋環復合物并結合于NFATc2啟動子上激活其轉錄表達，進而NFATc2蛋白表達入核并轉錄上調炎癥相關因子，即STAT3/MSK1/NFATc2信號軸在促進炎癥和胃癌的發生、發展中發揮重要作用。與此同時，Chen等[9]在鼻型自然殺傷細胞/T細胞淋巴瘤的研究中發現，PTPRK的DNA甲基化抑制其表達，解除了對STAT3的去磷酸化修飾和信號激活的抑制。因此推測，DNA甲基化介導的PTPRK-STAT3-NFATc2信號軸在OSCC發展進程中具有重要作用，有望成為治療靶點。

通常狀態下，NFATc2以高度磷酸化修飾存在于胞質中，當細胞受到異常刺激作用時，NFATc2作為鈣調磷酸酶的底物去磷酸化，隨后入核發揮其轉錄調控炎癥相關因子的作用[20]。盡管本實驗并沒有檢測其磷酸化修飾狀態，但是其磷酸化修飾后的入核現象在OSCC組織和SCC25細胞系中均已被證實，表明其主要在細胞核中發揮炎癥調節的功能并促進腫瘤的發生。另外，該研究結果提示，NFATc2去磷酸化修飾的鈣調磷酸酶抑制劑的應用，如他克莫司(tacrolimus, FK506)或環孢素A(cyclosporine A)是否在OSCC中具有抑制腫瘤的治療作用將是本課題組今后的研究方向。最后，本實驗從臨床角度證實了PTPRK下游NFATc2的表達上調和入核增加與OSCC病理分期和分化程度相關，提示該基因在OSCC的診斷和治療方面具有重要意義，其相關分子機制研究是課題組下一步的工作重點。