C57BL/6小鼠在肥胖建模過程中常見問題及處理對策*

孫 奧 馬玉蘭 胡曉琴 謝夢潔 穆蘭馨 夏 敏 鄢友娥

(武漢大學基礎醫學院藥理學系，武漢 430071)

1 C57BL/6小鼠簡介及用途

1.1 C57BL/6小鼠簡介

C57BL品系小鼠是在1921年用Lathrop小鼠作近親培育時，將57號雄性小鼠和52號雌性小鼠交配，培育而成[1]。C57BL/6小鼠是目前應用最廣泛的近交系小鼠，也是首個完成基因組測序的小鼠品系[2]。C57BL/6小鼠的皮毛是黑色，它們與BALB/c等溫順的小鼠相比，攻擊性更強，對噪聲和氣味也更敏感[3]。C57BL /6小鼠具有許多不尋常的特性，例如：它對疼痛異常敏感，因而鎮痛藥對它的效果不明顯[4]。與大多數小鼠品系不同，C57BL /6小鼠有自愿飲用酒精的特征。并且與其他小鼠相比更易對嗎啡成癮，也更容易患動脈粥樣硬化和年邁導致的聽力障礙[5]。

1.2 C57BL/6小鼠用途

C57BL/6小鼠用途非常廣泛，其主要應用領域有：①糖尿病和肥胖癥研究，如飲食導致的血糖過高、2型糖尿病、高胰島素血癥、胰島素抵抗、肥胖癥等。②血液及免疫系統疾病研究，包括：造血缺陷、免疫、炎癥和自身免疫性疾病。③遺傳學研究：基因突變和轉基因小鼠生產等。C57BL/6小鼠對肥胖易感，容易受飲食誘發肥胖、2型糖尿病和動脈粥樣硬化[6]。研究人員還發現，不同品系小鼠飼喂相同的高脂飼料后，C57BL/6小鼠的體質量、內臟脂肪重量、Lee’s 指數、脂肪細胞體積改變均比其他品系小鼠顯著。因此C57BL/6小鼠比其它品系小鼠更適合用來復制肥胖模型[7]。目前，C57BL/6小鼠被廣泛用于代謝性疾病的研究特別是用于肥胖模型的復制[2]。

1.3 C57BL/6飼養特點

C57BL/6小鼠的飼養與普通小鼠有一定的區別。C57BL/6小鼠被廣泛用于肥胖模型的造模，因此以肥胖模型C57BL/6小鼠的飼養為例，歸納總結特點如下：

1.3.1飼養飼料： 由于C57BL/6小鼠具有肥胖遺傳傾向，凡適用于大鼠和小鼠肥胖模型造模飼料，都可以用在C57BL/6小鼠中進行肥胖模型復制。在研究中，C57BL/6小鼠常用肥胖模型飼料主要有三種，脂肪供能比分別為60%、45%和21%。脂肪供能比為60%和45%的高脂飼料，其主要脂肪來源是富含飽和脂肪酸的豬油，主要成分為酪蛋白、糊精、蔗糖、纖維素、豆油、豬油、膽堿等[8]。脂肪供能比為21%的西方飲食飼料，其主要脂肪來源是奶油，配方中含有0.15%的膽固醇和34%的蔗糖。其主要成分為：酪蛋白、淀粉、糊精、蔗糖、纖維素、奶油、玉米油、礦物質、維生素、膽堿等[9]。

1.3.2磨牙棒的使用：小鼠的門齒會不斷生長，因此飼養過程中必須進行磨牙，否則會因為門齒過長而無法進食。為了滿足C57BL/6小鼠磨牙的需求，小鼠飼料都是質地較為堅硬的顆粒。但是飼料也淪為了它們磨牙的工具，這就會導致飼料浪費和攝食量測量不準確。另外，在C57BL/6小鼠肥胖模型復制過程中會用到特殊飼料(高脂、高糖)，這些飼料質地柔軟，飼料浪費的現象更為嚴重。通過在鼠籠內放置磨牙棒的方法，既能節約飼料又能豐富小鼠日常生活，并能防止小鼠牙齒過長[10]。

1.3.3C57BL/6小鼠用于肥胖模型復制的注意事項：首先要注意性別和年齡的選擇。雄性C57BL/6小鼠比雌性對肥胖更易感，因此一般選用雄性小鼠復制肥胖模型。C57BL/6小鼠肥胖發展速度較快，應當盡可能在生長發育期或成年前對其進行實驗。其次，要考慮肥胖誘因。肥胖的誘因復雜多樣，如，高糖、高脂飲食、繼發性胰島素抵抗、2型糖尿病、高血脂、非酒精性脂肪肝、高血壓等代謝綜合癥所致的肥胖，即飲食因素直接導致的肥胖和飲食所致疾病間接導致的肥胖兩方面。因此，我們應根據自身實驗目的及動物特性進行合理設計和選擇實驗動物。最后，環境因素對肥胖的作用。應當注意C57BL/6小鼠非常膽小，環境改變很容易引起它的應激反應，從而有可能出現體質量不增反降。因此，在復制肥胖模型過程中，要注意環境控制，尤其是頻繁灌胃、或研究環境因素對肥胖的效應時，應當謹慎考慮是否采用C57BL/6小鼠進行造模。

2 肥胖模型飼養過程中出現的常見問題

研究發現，人類肥胖癥患者中大約有95%的人群是單純性肥胖[11]。為了模仿單純性肥胖，一般采用高熱量、高脂肪飲食誘導的方式建立肥胖模型[12]。根據文獻，C57BL/6小鼠持續高脂喂養12周左右是常用建立肥胖動物模型的方式；判斷肥胖模型常用標準是高脂組體質量超過正常組平均體質量20%[13]。根據我們預實驗結果，45%高脂飲食喂養9周時接近肥胖標準，繼續喂養至12周時體質量穩定超過正常組平均體質量20%。因此，實驗設計中常用高脂喂養C57BL/6小鼠12周以建立穩定肥胖動物模型。建立C57BL6小鼠肥胖模型，看似簡單，但造模時間長，且會經歷C57BL/6小鼠性成熟時期，還會遇到各種問題，如果處理不當就會導致造模失敗。現總結我們在利用C57BL/6小鼠復制肥胖模型過程碰到的常見問題。

2.1 打耳標引起的耳朵感染

由于C57BL/6小鼠皮毛是黑色，因此不能使用苦味酸標記，一般采用打金屬耳標的方式進行標記。打耳標之后一周左右，少數小鼠會出現耳部感染的情況。具體表現為耳標周圍的組織紅腫、血管突出，并且會有淡黃色組織液滲出，更嚴重的會出現膿液(見圖1-A)。

產生耳朵局部感染現象可能有以下幾個原因：打耳標前后耳部和耳標沒有消毒，或者消毒不徹底；打完耳標之后由于小鼠不適應，會抓撓耳標；或因其他小鼠搔抓、打斗，導致傷口擴大，甚至耳標脫落、耳朵撕裂，最終引起傷口感染。

2.2 脫毛

飼養C57BL/6過程中，常常觀察到一些小鼠的胡須脫落或頭部、肩部、背部和生殖器周圍脫毛。脫毛現象一般出現在雄鼠性成熟之后，特別是小鼠重新分籠之后脫毛現象會更嚴重(見圖2-A)。導致小鼠脫毛的原因可分為兩類，生理性因素：包括生活習性、遺傳因素、內分泌失調、營養不良等。病理性因素：包括寄生蟲、細菌、真菌引起的感染等其他疾病。由于現在小鼠飼養環境越來越規范，動物房都配備了先進的飼養設備，把小鼠與外來致病因素隔離開，病理性因素導致的脫毛已經很少見[14]。因此，C57BL/6小鼠脫毛現象主要是其特有的理毛行為造成的，也被稱為Dalila效應[15]。當C57BL/6小鼠出現理毛行為時，鼠籠里通常會有一只動物皮毛正常。在通常情況下，脫毛小鼠能夠在幾周內重新長出被毛，但新生長的被毛比較稀疏，局部區域仍有小部分皮膚裸露。

理毛的原因可能有以下幾種：社會地位、遺傳傾向、環境或飲食惡劣。研究發現，只有在通過打斗建立鼠籠里的社會等級之后才能觀察到理毛現象，這表明理毛是為了確立支配地位的表現[16]。還有研究發現，這種理毛現象主要發生在C57BL/6和A2G小鼠中，這表明Dalila效應受遺傳因素影響[17]。另一項研究表明，理毛可能是對環境改變的一種反應。研究者發現小鼠被分籠后，理毛現象加重，而在鼠籠中放入玩具會減少理毛現象[18]。

2.3 打架引起的外傷

C57BL/6小鼠生性攻擊性強，經常會互相撕咬。小鼠打架會造成脫毛，撕咬嚴重的就會造成外傷，常見于頭、頸、背、尾等處的咬傷，如果未加處理，則可繼發感染、甚至死亡，這會影響小鼠的健康和實驗數據的準確性。小鼠打架經常出現在性成熟時期和分籠之后。小鼠打架的原因主要有：品系特點、爭奪群體地位、確定勢力范圍、搶奪食物、氣味、應激反應等。①品系特點：不同品系的小鼠性格特點也不一樣，比如C57BL/6的雄鼠攻擊性特別強，到了性成熟的周齡后不同窩的雄鼠放在同一籠很容易互相撕咬。②爭奪群體地位：雄性小鼠為了爭奪群體地位，常常進行激烈的打斗，最終選出一位領導者。③確定勢力范圍：小鼠會劃定自己的勢力范圍并守衛這個范圍。④氣味：氣味信息是小鼠之間交流的一種途徑，可以識別親屬以及宣誓群體地位，因此它也會給小鼠飼養造成一些麻煩，比如同一籠的雄性小鼠，聞到其他小鼠的味道之后，會變得暴躁并產生攻擊行為。⑤環境對小鼠造成的應激反應：生活在一個充滿壓力的環境中，可能會使小鼠產生攻擊打斗行為[19]。

3 C57BL/6小鼠復制肥胖模型飼養中的常見問題處理對策及效果評價

我們課題組在近兩年的肥胖模型動物飼養過程中，根據發現的問題，查閱文獻資料、思考對策，并多次實踐，處理效果較為明顯，現總結如下：

3.1 打耳標引起的耳朵感染處理方法

不論何種原因引起打耳標處感染，都可以很好預防和及時處理。處理方法：首先，在打耳標之前要嚴格無菌操作，用酒精和碘伏對小鼠耳朵和耳標進行消毒。還要注意，打耳標時盡量打到耳朵中部，不能太靠近耳緣，這樣耳標就不容易脫落。如果因小鼠自身或其他小鼠搔抓后已經出現感染，則要每天用碘伏進行消毒，直到傷口愈合，根據傷口大小，大約需要5～7d時間可以痊愈(見圖1-A～D)。

圖1 耳朵感染處理效果

3.2 脫毛處理方法

理毛行為一般對小鼠的健康沒有危害，脫毛部位的皮膚一般沒有傷口或紅腫。萬一出現理毛過度造成皮膚潰瘍，建議用碘伏涂抹傷口，一天1～2次，一周左右可以改善(見圖2-A～D)。如果一籠小鼠中只有一只小鼠有完整的皮毛，那么它就是“吃毛”小鼠。把這只小鼠從籠中拿出隔離之后，其它小鼠的被毛通常就會恢復。

圖2 背部脫毛處理效果

3.3 C57BL/6小鼠打架的預防措施

攻擊性強是C57BL/6小鼠的特性，特別是雄性小鼠性成熟之后，為了爭奪領地小鼠之間的打斗會變得頻繁。而這一特性與生俱來，沒有特別好的辦法避免。我們可以采取以下措施來減少這種打架現象：①小鼠分籠時最好把同一個運輸盒的小鼠分到同一個鼠籠中；且盡量避免在性成熟期分籠；或者分籠時用酒精噴一下鼠籠和小鼠，掩蓋氣味；②更換墊料時，可以抓取少量舊墊料撒在新墊料表面，這樣可以使新籠中留存原有的氣味；③盡可能降低小鼠飼養密度：條件許可情況下，建議每籠飼養2～3只；特殊情況下，采取單籠單只飼養；④每天觀察小鼠的狀況，一旦發現鼠籠中有撕咬打斗現象，要將最強者挑出單籠隔離飼養；同時對輕微受傷個體，每天用碘伏消毒，一般5～7d可以痊愈。如果傷口太嚴重，應予以剔除；⑤最好不要頻繁更換實驗人員，以降低不確定因素對小鼠的應激刺激。

4 總結

由于C57BL/6小鼠與普通小鼠有許多差別，且高脂誘導肥胖動物模型歷時長、高脂飼料軟，因此肥胖動物飼養過程中會出現各種問題，造成實驗結果出現偏差。因此要仔細觀察動物狀態，及時發現異常，并且采用合理的方法及時預防和處理，從而保證實驗順利進行。