輕度認(rèn)知功能障礙患者載脂蛋白E基因、亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與情景記憶能力的關(guān)系

于小琪 陳勁龍 王雙艷 李晴 劉豐

廣州市第一人民醫(yī)院老年病科（廣州510180）

輕度認(rèn)知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）是處于正常衰老和癡呆之間的一種中間狀態(tài)，是癡呆的早期臨床階段。MCI 患者伴有記憶能力、注意力、定向力、計算能力等認(rèn)知功能中一種或數(shù)種能力下降，但日常生活可以自理。認(rèn)知功能下降中又以記憶能力下降比較多見，記憶能力中又以情景記憶（episodic memory，EM）能力下降比較常見［1-3］。有研究表明［4-5］，載脂蛋白E（ApoE）基因、MTHFR 基因能導(dǎo)致MCI 的發(fā)病，因此本實驗利用情景記憶成績來檢測、評價MCI 患者認(rèn)知功能；并分析ApoE 基因、MTHFR 基因多態(tài)性與廣州市老年人MCI 的相關(guān)性，提高人們對MCI 遺傳易感性認(rèn)識，從而闡明老年人MCI 發(fā)生的遺傳背景和機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料根據(jù)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)［6-7］，選取2018年1月至2020年3月在廣州市第一人民醫(yī)院老年病科住院及體檢MCI 患者109 例，正常對照組（NC 組）118例，MCI組及NC組性別男/女比例分別為67/42、65/53；年齡分別為（76 ± 5）、（73 ± 5）歲；文化程度分別為（9±1）、（11±2）年。所有研究對象均來自廣州市、應(yīng)用簡易精神狀態(tài)量表（MMSE）、六條目量表（SIS）、臨床癡呆評定量表（CDR）對所有入組人員進(jìn)行檢測，同時進(jìn)行情景記憶編碼能力、提取能力測試，并進(jìn)一步統(tǒng)計所有入組人員情景記憶編碼成績和提取成績的變化，以及編碼反應(yīng)時間、提取反應(yīng)時間的差別。并進(jìn)行ApoE 基因、MTHFR 基因檢測及相關(guān)性分析。

1.2 MCI 組與NC 組間情景記憶編碼過程和提取過程檢測

1.2.1 編碼過程檢測首先編制好40幅圖畫，每幅圖畫顯示8 s，30 min 后入組者觀看這40 幅圖畫，并判斷觀看過哪些圖畫。用編碼成績表示編碼記住率，REM（Remember）：REM=記住數(shù)/40×100%［8?9］。

1.2.2 提取過程檢測首先編制好16 幅圖畫，入組者先看這16 副圖畫，每幅圖畫顯示8 s，30 min后入組者需要觀看32 幅圖畫（其中包括先前看過的16 副圖畫），并判斷哪些圖畫觀看過。提取成績用圖畫提取率標(biāo)記RET（Retrieval）：RET=正確數(shù)/32×100%［8?9］。

1.3 MCI 組與NC 組間ApoE 基因、MTHFR 基因C677T位點基因多態(tài)性分析取受檢者靜脈血2 mL，EDTA 抗凝，提取人類白細(xì)胞基因組DNA（試劑由上海百傲科技有限公司提供）。采用熒光探針法檢測病人ApoE 基因型。使用ApoE 基因分型檢測試劑盒（PCR?熒光探針法）（武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司）檢測ApoE 基因多態(tài)性。采用聚合酶鏈反應(yīng)?限制片段長度多態(tài)性法檢測MTHFR 基因C677T 位點基因多態(tài)性［10］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。基因型分布經(jīng)Hardy?Weinberg 平衡定律檢驗群體代表性。計量資料用（）表示，兩個組之間比較采用獨立樣本t檢驗，多個組之間比較采用One?Way ANOVA；計數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；各基因型對廣州市漢族老年人MCI 的影響采用多元logistic 回歸分析方法進(jìn)行統(tǒng)計分析，分別計算各自的優(yōu)勢比（OR）及95%CI。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較MCI 組及NC 組間性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.62，P=0.39）；兩組間年齡相比較，結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t= 0.57，P=0.43）；兩組間文化程度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.3，P=0.22）。

2.2 MCI 組與NC 組間情景記憶成績的比較本研究結(jié)果顯示兩組間情景記憶編碼成績差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.017）；兩組間提取成績比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.025）；兩組間編碼反應(yīng)時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.030）；兩組間提取反應(yīng)時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012），見表1。

表1 MCI 組與NC 組間情景記憶成績比較Tab.1 Episodic memory results in MCI group and control group±s

表1 MCI 組與NC 組間情景記憶成績比較Tab.1 Episodic memory results in MCI group and control group±s

編碼成績（分） 編碼反應(yīng)時間（ms） 提取成績（分） 提取反應(yīng)時間（ms）分組MCI 組NC 組χ2值P 值例數(shù)109 118 58.90±18.90 72.30±22.80 11.438 0.017 2 815±580 2 084±562 9.576 0.025 57.40±16.22 75.00±21.30 8.543 0.030 3 278±866 2 100±688 13.162 0.012

2.3 基因檢測結(jié)果

2.3.1 Hardy?Weiberg 平衡檢驗兩組間ApoE 基因、MTHFR 基因型頻率分布進(jìn)行Hardy?Weiberg平衡檢驗，結(jié)果證明符合該定律（P>0.05）。ApoE基因型：MCI 組χ2= 0.030，P= 0.982；NC 組χ2=0.001，P= 0.998；MTHFR C677T 基因型：MCI 組χ2= 1.143，P= 0.285；NC 組χ2= 0.693，P= 0.412，結(jié)果符合Hardy?Weiberg 遺傳平衡定律。

2.3.2 ApoE 基因多態(tài)性檢測基因型檢測發(fā)現(xiàn)共含有ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4 和ε4/ε4六種基因型（圖1），兩組間基因型差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.032，表2）。與其他基因型比較，ε3/ε4 和ε 4/ε4 基因型可能更易患MCI（OR= 3.129，95%CI：1.628 ～8.97；OR=1.326，95%CI：1.003～2.001）。

表2 兩組間ApoE 基因型頻率Tab.2 ApoE genotype allelic frequency between the two groups 例（%）

2.3.3 MTHFR 基因C677T 位點多態(tài)性檢測基因檢測發(fā)現(xiàn)兩組均含有MTHFR 基因C677T 位點CC、CT、TT 三種基因型（圖2），兩組基因型間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.004，表3）。TT 基因型更易患MCI（OR=3.216，95%CI：0.641～16.052）。

圖2 MTHFR 基因C677T 位點檢測結(jié)果Fig.2 The genechip map of MTHFR gene C677T genotype

表3 兩組間MTHFR 基因C677T 位點基因型頻率Tab.3 MTHFR gene C677T genotype allelic frequency between the two groups例（%）

2.3.4 MCI 組與NC 組間ApoE 基因型間情景記憶成績比較結(jié)果顯示MCI組和NC組間ε2/ε3、ε3/ε3、ε3/ε4 基因型間情景記憶編碼成績和提取成績差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表4。

2.3.5 MCI 組與NC 組間MTHFR 基因C677T 位點各基因型間情景記憶成績比較本研究結(jié)果顯示CC、CT、TT 基因型間情景記憶編碼成績和提取成績差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表5。

表4 ApoE 各基因型間情景記憶成績比較Tab.4 Episodic memory results in different ApoE genotype ±s

表4 ApoE 各基因型間情景記憶成績比較Tab.4 Episodic memory results in different ApoE genotype ±s

ApoE 基因型ε2/ε3 ε3/ε3 ε3/ε4 MCI 組NC 組MCI 組NC 組MCI 組NC 組計數(shù)［例數(shù)（%）］9（8.4）18（15.2）83（76.1）86（72.9）13（11.9）8（6.9）編碼成績（分）58.17±33.95 72.50±12.65 51.53±30.82 68.06±32.19 45.71±27.20 63.21±53.17編碼反應(yīng)時間（ms）2 568±124 2 067±241 2 834±578 2 204±176 3 107±253 2 458±379提取成績（分）60.32±12.56 75.21±17.08 57.86±67.03 72.86±12.63 52.08±13.72 69.02±18.56提取反應(yīng)時間（ms）3 008±159 2 006±843 3 187±548 2 109±112 3 409±136 2 304±531 χ2值7.378 10.03 6.42 P 值0.028 0.014 0.035

表5 MTHFR 不同基因型間情景記憶成績比較Tab.5 Episodic memory results in different MTHFR gene C677T genotype ±s

表5 MTHFR 不同基因型間情景記憶成績比較Tab.5 Episodic memory results in different MTHFR gene C677T genotype ±s

MTHFR 基因型CC CT TT組別MCI 組NC 組MCI 組NC 組MCI 組NC 組計數(shù)［例數(shù)（%）］47（43.1）46（39.0）38（34.9）59（50.0）24（22.0）13（11.0）編碼成績（分）64.13±18.56 78.34±13.21 56.32±25.13 76.17±20.03 51.63±24.01 71.32±17.74編碼反應(yīng)時間（ms）2 815±246 2 168±342 2 891±145 2 199±564 3 178±412 2 538±514提取成績（分）58.32±17.56 78.71±34.80 51.35±18.62 74.50±19.01 49.56±18.09 68.21±24.59提取反應(yīng)時間（ms）2 819±367 2 190±125 3 190±724 2 431±526 3 389±806 2 658±413 χ2值9.072 11.937 4.256 P 值0.026 0.019 0.038

3 討論

情景記憶（episodic memory）通常是指以時間和空間為坐標(biāo)對個人親身經(jīng)歷的、發(fā)生在一定時間和地點的事件（情景）的記憶過程。情景記憶包括編碼、鞏固、儲存和提取幾個階段，其中編碼過程是人們對新遇到各種信息的處理和加工過程，提取過程是對已經(jīng)儲存在大腦中的信息進(jìn)一步再利用的過程。相關(guān)研究顯示MCI 患者的情景記憶的編碼能力降低比較明顯［11-13］。本研究檢測所有入組人員情景記憶成績，并發(fā)現(xiàn)MCI 組患者情景記憶編碼成績、提取成績都較NC 組有下降，編碼反應(yīng)時間、提取反應(yīng)時間與NC 組相比也有延長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。 這一結(jié)果與以往研究結(jié)果相一致，這可能與年齡增長相關(guān)，隨著年齡增加，腦萎縮加重，情景記憶相關(guān)腦功能區(qū)也出現(xiàn)萎縮，導(dǎo)致情景記憶成績下降；另外隨著病情進(jìn)展，MCI 患者突觸連接的減少以及功能的缺陷，使得情景記憶編碼時間、提取時間延長［14-16］。所以，本研究認(rèn)為廣州市老年人MCI 患者的情景記憶編碼能力和提取功能均存在異常。

近些年來，伴隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，MCI相關(guān)基因?qū)W的研究被廣泛關(guān)注［17-19］。載脂蛋白E（ApoE）基因在MCI 發(fā)病中發(fā)揮重要作用，ApoEε4等位基因也被認(rèn)為是MCI 發(fā)病的危險因素，攜帶ApoEε4 等位基因能增加MCI 的發(fā)病風(fēng)險。ApoE基因被認(rèn)為是癡呆發(fā)生最重要的遺傳因素之一。三種ApoE 等位基因組合成6 種基因型。ApoE 基因與脂質(zhì)代謝和Aβ聚集和沉積、MTHFR 基因和Hcy 代謝有著緊密的聯(lián)系，且與癡呆的發(fā)生密切相關(guān)。在ApoE 等位基因中，ε4 等位基因攜帶者因產(chǎn)生不穩(wěn)定的ApoE 異構(gòu)體引起機(jī)體總ApoE 血清水平降低和ApoE 功能異常，從而有可能引起脂質(zhì)的代謝紊亂和神經(jīng)元功能損傷［20-22］。本研究發(fā)現(xiàn)廣州市老年人攜帶ε3/ε4 和ε4/ε4 基因型更易患MCI。這一結(jié)果與以上研究結(jié)果相一致。并且本實驗進(jìn)一步比較ApoE 不同基因型間情景記憶編碼及提取成績的差別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同基因型間MCI 患者情景記憶編碼及提取成績都有下降，攜帶ApoEε4 等位基因成績下降更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

MTHFR 基因位于染色體lp36 區(qū)域，編碼Hcy代謝的關(guān)鍵酶。MTHFR 基因C667 位點C?T 基因突變引起Hcy 代謝通路受阻，從而引起Hcy 血清水平升高，MTHFR 基因C677T 位點TT 基因型提高了癡呆患者Hcy 水平。Hcy 則存在氧化應(yīng)激、脫甲基化、腦血管損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、Aβ升高及tau 蛋白磷酸等潛在機(jī)制促進(jìn)老年性癡呆的發(fā)生［23-25］。癡呆患者中TT 基因型頻率和T 等位基因頻率的比例高于對照組［26-27］。此觀點與本實驗得出結(jié)論相一致。本實驗發(fā)現(xiàn)廣州市老年人攜帶MTHFR TT 基因型更易患MCI，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MTHFR C667 不同基因型間情景記憶編碼及提取成績有差異。

綜上所述，根據(jù)本研究表1 結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，廣州市老年人MCI 病人的情景記憶編碼和提取功能存在異常。根據(jù)表2、3 中OR值得出ApoE、MTHFR基因多態(tài)性是廣州市老年人MCI發(fā)病的獨立危險因素。根據(jù)表4、5 中的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)ApoE、MTHFR不同基因多態(tài)性對廣州市老年人MCI 患者情景記憶編碼、提取成績有影響。ApoE 基因多態(tài)性、MTHFR 基因多態(tài)性在MCI 的遺傳易感性中的可能的作用機(jī)制仍有爭議，有待進(jìn)一步研究。本研究也存在入組人群局限性，樣本量不大等原因，需要進(jìn)一步擴(kuò)大區(qū)域以及樣本進(jìn)行研究，從而為MCI 診治提供重要依據(jù)。