茵黃口服液的安全藥理學試驗

李紫元，肖潔怡 , 龍小鈴，莫 藍 , 梁偉燊，劉俊丹，邱文才，倫健熾，何永明，唐陸平

(佛山科學技術學院獸醫系，廣東 佛山 528000)

安全藥理學主要研究藥物在治療范圍或超出治療范圍劑量時，出現潛在的藥物不良影響[1]，是新藥臨床前安全性評價的重要組成部分。一般設計3個劑量組(其中低劑量組應不低于臨床擬推薦劑量、高劑量組應以不產生嚴重毒性反應為限)，原則上應與臨床擬用途徑一致，采用單次給藥[2]。心血管系統、呼吸系統和中樞神經系統是維持生命的重要系統，臨床前安全藥理學試驗必需完成對這些系統的核心組合觀察[3]。茵黃口服液由茵陳和黃芩按2∶1比例組成，常規方法制備口服液，臨床擬用于治療畜禽藥物性急性肝損傷。本文參照《獸用中藥、天然藥物安全藥理學研究技術指導原則》對茵黃口服液的安全藥理學進行試驗。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 MC4000小動物無創血壓分析儀，美國Hatteras公司；EMKA小動物無創肺功能檢測系統，法國EMKA Technologies公司；YLS-1B多功能小鼠自主活動記錄儀，山東省醫學科學院設備站；XZC-5C小鼠轉棒式疲勞儀，山東省醫學科學院設備站。

1.2 主要試劑和藥物 戊巴比妥鈉(進口分裝)；茵陳(批號20170525)購自北京本草方源藥業集團有限公司；黃芩(批號70550601)購自北京三和藥業有限公司。茵黃口服液小試產品，本實驗室自制。

1.3 實驗動物及飼喂 SPF級KM小鼠，體質量(20±2)g。所有動物雌雄各半，由廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(粵)2013-0002。高壓滅菌全價顆粒飼料，由廣東省實驗動物中心提供；給料方式自由攝取。飲用水，瓶裝蒸餾水，由動物飲水瓶自由攝取。墊料為消毒木屑，由廣東省實驗動物中心提供。

實驗動物飼養管理的環境條件：屏障系統內飼養，溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，換氣次數10～ 20 次/h，從購入日算作第1天，檢疫與馴化期共為3 d。期間對外觀、一般狀態進行觀察，待穩定后試驗。

1.4 心血管系統、呼吸系統相關指標測定 KM小鼠隨機分為4組，每組20只，雌雄各半，茵黃口服液按高劑量組[20 g/(kg·bw)]、中劑量組[10 g/(kg·bw)]、低劑量組[5 g/(kg·bw)]灌服，灌胃體積0.2 mL/(10 g·bw)，空白對照組灌服等體積的蒸餾水。分別使用MC4000無創血壓分析儀和EMKA無創肺功能分析儀記錄給藥前(-1 h)、給藥后(0、1、2 h和4 h)的血壓、脈搏、呼吸頻率、呼吸間隙和潮氣量等相關指標[4-5]。

1.5 神經系統相關指標測定

1.5.1 對戊巴比妥鈉閾劑量催眠作用的影響 KM小鼠數量、分組及給藥方法同1.4，給藥50 min后，4組小鼠均腹腔注射50 mg/(kg·bw)閾劑量戊巴比妥鈉，出現翻正反射消失為入睡時間，從翻正反射消失至恢復時間為睡眠持續時間。記錄每只小鼠睡眠時間[6]。

1.5.2 對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響 KM小鼠數量、分組及給藥方法同1.4，給藥50 min后，4組小鼠均腹腔注射25 mg/(kg·bw)閾下劑量戊巴比妥鈉，小鼠翻正反射消失1 min以上為睡眠，記錄給藥后30 min內睡眠小鼠只數。

1.5.3 對一般狀態、自主活動的影響 KM小鼠數量、分組及給藥方法同1.4，在給藥后10、30 min和60 min，使用小鼠活動記錄儀記錄小鼠10 min內的活動次數，并對小鼠生理狀態進行觀察。

1.5.4 對機能協調運動的影響 篩選出在轉棒式疲勞儀上運動3 min(16 r/min)不墜落的KM小鼠80只，分組及給藥方法同1.4，于給藥后50 min，使用轉棒式疲勞儀(16 r/min)觀察小鼠機能協調運動(1 min和3 min內的轉棒墜落率)。

1.6 統計學方法 數據收集整理采用Excel表格，采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行統計學處理。先對資料作一般描述性分析，計算各計量資料的平均數、標準差，計數資料用百分數(%)表示。計量資料先作正態性檢驗，符合正態分布及方差齊性采用單因素方差分析；非正態分布或方差不齊采用秩和檢驗。計數資料采用卡方檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 茵黃口服液對心血管系統的影響 結果見表1。茵黃口服液給藥4 h后，高劑量組和低劑量小鼠的收縮壓、舒張壓顯著低于對照組(P<0.05)；小鼠脈搏相同時間點各組之間比較均不具有顯著性差異(P>0.05)。

2.2 茵黃口服液對呼吸系統的影響 結果見表2。茵黃口服液給藥后，各組相同時間點的呼吸頻率、潮氣量比較均沒有顯著性差異(P>0.05)。各組的呼吸曲線正常。

2.3 茵黃口服液對神經系統的影響

2.3.1 對戊巴比妥鈉閾劑量催眠結果的影響 小鼠入睡時間，茵黃口服液高劑量組為(4.05±1.40) min、中劑量組為(9.4±8.1) min、低劑量組為(9.00±6.79) min、對照組為(11.47±11.27) min，高劑量組較對照組顯著減少(P<0.05)；睡眠維持時間，茵黃口服液高劑量組為(46.85±20.42) min、中劑量組為(38.26±19.22) min、低劑量組為(39.9±21.49) min、對照組為(32.58±23.09) min，高劑量組較對照組顯著延長(P<0.05)。

2.3.2 對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠結果的影響 閾下劑量催眠率，高劑量組為10%(2/20)、中劑量組為5%(1/20)、低劑量組為10%(2/20)、對照組為0%(0/20)，組間比較差異無顯著性(P>0.05)。

表1 茵黃口服液對小鼠收縮壓、舒張壓和脈搏的影響Table 1 Effect of Yinhuang oral liquid on systolic arterial pressure,diastolic arterial pressure and pulse in mice (n=20)

2.3.3 對一般狀態、自主活動的結果 各組小鼠姿勢、步態均正常，活動無異常，毛色光滑，無流涎、肌顫及瞳孔等變化。給藥前1 h和給藥后10、30 min和60 min的活動次數，高劑量組分別為(206.8±40.0)次、(129.9±56.1)次、(144.1±51.7)次和(134.8±45.5)次；中劑量組為(196.8±26.5)次、(166.1±38.9)次、(151.6±39.0)次和(158.9±36.2)次；低劑量組為(198.1±22.2)次、(156.4±42.0)次、(153.0±36.8)次和(149.3±42.9)次；對照組為(192.7±39.5)次、(158.3±28.4)次、(142.8±32.1)次和(143.1±39.2)次。各組相同時間點自由活動次數比較均無差異顯著性(P>0.05)。

2.3.4 對機能協調運動的結果 高劑量組小鼠1 min轉棒墜落率為10%(2/20)，對照組小鼠3 min轉棒墜落率為10%(2/20)，其余組別和時間均為0%。各組小鼠的轉棒墜落率相同時間點比較差異無顯著性(P>0.05)。

3 討論

3.1 茵黃口服液對心血管系統的影響 沈飛海等發現茵陳提取物灌胃對大鼠有一定的降血壓作用，其機制與顯著下調大鼠體內的血管緊張素Ⅱ和血清NO的水平有關[7]。茵陳中的香豆素化合物，靜脈注射家兔，可顯著降低血壓，并且隨著用藥量的增加，血壓下降程度和時間也有增加和延長[8]。黃芩苷有擴張血管，降低血壓的作用，主要機制是通過阻滯平滑肌細胞膜上的電壓依賴型鈣通道和受體操縱型鈣離子通道使細胞內的鈣離子濃度升高[9]。另有研究表明，黃芩苷有排鈉利尿的作用，減少外周血容量和心臟血輸出量，使得血壓下降。黃芩素不會影響正常大鼠的血壓，對高血壓大鼠有降壓作用[10]。推測用藥后4 h高劑量和低劑量組血壓下降與茵陳中的香豆素和黃芩中的黃芩苷等的降壓作用有關。中劑量組個別小鼠的血壓較高(導致標準差明顯偏高)，推測儀器通道本身存在的問題抑或尾套血壓測試方法的問題[11-12]，未能體現出降壓作用。是否如此，值得進一步探索。

表2 茵黃口服液對小鼠呼吸頻率的影響Table 2 Effect of Yinhuang oral liquid on respiratory frequency of mice (n=20)

3.2 茵黃口服液對呼吸系統的影響 黃芩主入肺經，長于清肺熱，為治療肺熱咳喘之要藥；單用有效，即清金丸(《丹溪心法》)。黃芩對急性肺損傷有一定的治療作用[13]，黃芩苷可通過調節TH1/TH2和Th17/Treg等通路治療過敏性哮喘[14-15]。這提示黃芩對呼吸急促狀態下的呼吸頻率和潮氣量可能有一定的負向調節作用。茵黃口服液各劑量組的呼吸頻率、潮氣量、呼吸節律與空白對照組相同時間點比較，差異沒有顯著性，且均在正常范圍內[16]，這提示茵黃口服液在20 g/(kg·bw)范圍內給藥對正常動物的呼吸系統無明顯影響。

3.3 茵黃口服液對神經系統的影響 黃芩中的黃芩苷和黃芩素均有鎮靜作用，并且對神經有一定的保護作用。黃芩苷對睡眠和覺醒有雙向調節作用：光照期會抑制IL-1的活性減少慢波睡眠(SWS)，黑暗期會增強GABA(A)受體活性來增加SWS和快速眼動睡眠(REMS)[17]。黃芩素增加乙醚誘導的睡眠時間，藥理活性依賴于GABA的非苯二氮卓部位[18]。戊巴比妥鈉閾劑量催眠結果，茵黃口服液高劑量組小鼠的入睡時間顯著減少、睡眠維持時間顯著延長；戊巴比妥鈉閾下劑量催眠結果，茵黃口服液各劑量組均有小鼠睡眠。這提示茵黃口服液可能具有鎮靜催眠作用，且其鎮靜催眠作用與方劑中的黃芩有關。

小鼠一般狀態、自主活動的結果，同一時間點茵黃口服液各劑量組與對照組比較無差異顯著性(P>0.05)，但均較給藥前顯著減少，這與我們前期研究結果類似[6]，原懷疑與測量時間選擇有關(傍晚-深夜)，本次試驗排除此因素；懷疑與小鼠適應周圍環境和灌胃應激相關，需要做進一步的研究證明。

茵黃口服液對心血管系統、呼吸系統和神經系統安全藥理性研究表明，發現該方劑有一定的降壓作用，對神經系統有一定的鎮靜作用。