內消軟脈湯對ApoE-/-小鼠解耦聯蛋白1依賴性脂解通路、血脂及高敏C反應蛋白的影響

王可彬 李賀 吳圣賢

心腦血管疾病是威脅人類生命健康的重要原因[1-2]，高脂血癥及代謝性炎癥在許多心腦血管病發生及發展的過程中起到重要作用。目前現代醫學針對高脂血癥的主要治療措施是強化降脂治療，如長期服用他汀類藥物，但其具有一定的肝毒性及腎毒性[3]，且沒有針對性降低血管內代謝性炎癥的藥物，而中醫藥治療高脂血癥及代謝性炎癥具有顯著的療效并且副作用較小。本課題組結合多年臨床經驗，提出了“脈生痰核”的理論[4-5]，創立了“內消軟脈湯”用于治療頸動脈粥樣硬化，已取得顯著臨床療效，通過觀察臨床患者的治療效果以及進一步的探究，發現“內消軟脈湯”可以降低患者的血脂及炎癥水平。因“內消軟脈湯”屬于“化痰散結”類方劑，源于中醫外科治療“頸生痰核、臂生痰核”的方藥，故認為其作用部位在皮下。而大量研究表明，皮下脂肪的活化可顯著遏制動脈粥樣硬化發展并且穩定易損斑塊[6]，究其作用機制主要也是抑制代謝性炎癥[7]以及降低甘油三酯和膽固醇水平[6-8]，因此推測，“內消軟脈湯”可以抑制代謝性炎癥、降低甘油三酯和膽固醇水平，且這些功效是通過激活皮下脂肪活化來實現的，而皮下脂肪的激活嚴格依賴解耦聯蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)[9-10]，為驗證“內消軟脈湯”是否抑制代謝性炎癥及降低血脂水平，并探究此作用的實現是否與激活UCP1依賴性脂解有關，進行了以下實驗。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用7周齡雄性ApoE-/-小鼠48只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK：(京)016-0006。適應性飼養1周，飼養于北京中醫藥大學東直門醫院教育部重點學科實驗室動物實驗中心，室溫22℃，濕度45～55%，12 h/12 h：光照/黑夜循環，自由進食水。

1.2 實驗藥物與試劑

“內消軟脈湯”由陳皮9 g、茯苓9 g、姜半夏9 g、白僵蠶9 g、玄參9 g、生牡蠣9 g、海藻9 g、昆布9 g、炮山甲3 g、皂刺3 g、浙貝母9 g、天花粉9 g、夏枯草9 g、橘核9 g、醋鱉甲9 g、姜黃9 g、丹參9 g、當歸6 g、制乳香3 g、制沒藥3 g、炒白芥子6 g、白芷6 g、薄荷6 g、香附6 g、生黃芪9 g、靈芝9 g、金銀花9 g、黃連9 g組成，所有藥材購自北京康仁堂公司。4%多聚甲醛溶液(4%，PFA)，貨號：SS0312；中性快干膠，購自中杉金橋公司，貨號：ZLI-9516；兔抗GADPH抗體，購自PTG公司；山羊抗兔二抗試劑，購自北京普利萊公司，貨號：P1003；兔抗UCP1抗體，購自abcam公司，貨號：ab10983；5×蛋白上樣緩沖液，購自普利萊公司，貨號：B1012；BCA蛋白定量試劑盒BCA Reagent，購自普利萊公司，貨號：P1511；RIPA裂解液，貨號：C1053，購自普利萊公司；蛋白酶抑制，購自普利萊公司；SDS，購自普利萊公司；吐溫-20，購自普利萊公司，貨號：A1007；封閉專用脫脂奶粉，購自普利萊公司，貨號：P1622；預染色蛋白Maker，購自普利萊公司，貨號P1103；發光液，購自碧云天公司。

1.3 動物分組與造模[11]

48只ApoE-/-小鼠采用隨機數表法分為空白組、模型組、“內消軟脈湯”低劑量組、“內消軟脈湯”高劑量組，每組12只。各組小鼠適應性飼養1周后，除空白組給予正常飲食外，其余三組給予高脂飲食(21%脂肪+0.15%膽固醇)，持續60日，造模過程中無小鼠死亡。鑒于環境溫度對脂解作用有明顯影響，本研究采用環境動物飼養箱，全程控制并恒定飼養溫度為22°C。鑒于脂解過程中消耗熱量，會明顯增加小鼠食量，本研究將各組動物匹配飼養。

1.4 給藥

造模結束后第2天開始灌胃給藥，每天一次，連續60天。空白組和模型組予0.9%生理鹽水0.3 mL灌胃；“內消軟脈湯”低劑量組予“內消軟脈湯”混懸液68 mg/kg/d灌胃；“內消軟脈湯”高劑量組予“內消軟脈湯”混懸液102 mg/kg/d灌胃，每只小鼠的給藥體積為0.3 mL/d，其中低劑量組為臨床等效劑量，連續給藥56天，“內消軟脈湯”高劑量組小鼠在藥物干預過程中死亡1只。

1.5 標本采集處理過程

在給藥60天后對各組小鼠(除“內消軟脈湯”高劑量組11只外，其余組12只)進行取材，需要采集的樣本有：血清，肩胛區棕色脂肪組織、腹股溝皮下白色脂肪組織、附睪內臟白色脂肪組織。處死小鼠前禁食水8小時。使用眼球取血法采血，剪去小鼠嘴邊須毛，左手捏住頸后肌肉，保持頭低腳高位，固定小鼠頭部，右手持彎鑷快速夾除一側眼球，采血于1.5 mL離心管內，每只小鼠采血(200～300)μL血液，取血結束后，靜置，血樣待出現分層后，以3000 rpm×15 min的參數進行離心，取上層血清，凍存于-80℃冰箱，于協和醫院檢驗科以生化法檢測血脂和高敏C反應蛋白(high-sensitive C-reactive protein,HS-CRP)。采血完畢后，把小鼠浸泡于75%酒精中充分消毒并固定于自制小鼠手術臺，后采集小鼠肩胛兩側棕色脂肪組織、腹股溝皮下白色脂肪組織、附睪內臟白色脂肪組織。分別將一側脂肪組織放入凍存管內并立即放置于液氮中保存以備Western blot法檢測；另一側脂肪組織保存于4%多聚甲醛中以備HE染色。

1.6 指標檢測

1.6.1 生化法檢測各組小鼠血清TG、LDL、HS-CRP 以上指標均由北京協和醫院檢驗科檢測。

1.6.2 HE染色觀察脂肪細胞形態及大小 對各組小鼠的肩胛、腹股溝和附睪區脂肪組織(n=3)的石蠟切片進行HE染色，使用高倍顯微鏡拍攝幾個連續的切片照片，觀察脂肪細胞形態及大小來驗證脂肪組織的褐變情況。

1.6.3 Western blot法檢測UCP1在肩胛區、腹股溝處、附睪區的蛋白表達量 將組織用RIPA裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑(50∶1)充分消化，制成乳糜顆粒，然后在4℃冷凍離心機(Eppendorf 5424/5424R)中于12000 G離心10分鐘。用SDS-PAGE上樣緩沖液(1∶5，APPLYGEN)稀釋液體上清液中的蛋白質，并轉移至沸水中，然后-20℃保存。通過依次用6%+10%SDS-PAGE在60V下離心30分鐘分離加工的蛋白質，然后在100 V上調電壓下離心1小時，然后在300 mA的硝酸纖維素膜(APPLYGEN)上轉移1.5小時。轉移后，將膜在3%～5%的脫脂干奶中于常溫下封閉1小時。將膜與針對UCP1的一抗(1∶1000，abcam)在4℃孵育過夜，并用TBST洗滌，然后在室溫下與適當的二抗(ZSGB-BIO)孵育1小時。最終，使用輕質液體(BeyoECL星，BEYOTIME)通過化學發光檢測目標蛋白，并通過內部參照GADPH(1∶5000，abcam)將其標準化。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 “內消軟脈湯”對小鼠血脂水平及炎性因子的影響

與空白組比較，模型組的HS-CRP、TG、LDL水平未見明顯差異。與模型組比較，“內消軟脈湯”低劑量組、“內消軟脈湯”高劑量組的HS-CRP、TG水平均下降，具有統計學意義(P<0.05)，且HS-CRP在“內消軟脈湯”低劑量組下降程度更明顯。同時，與模型組比較，“內消軟脈湯”低劑量組的LDL也呈降低趨勢，但無統計學意義(P>0.05)。結果見表1。

表1 各組ApoE-/-小鼠血清中HS-CRP、TG、LDL水平的比較

2.2 “內消軟脈湯”對小鼠脂肪細胞棕色化的影響

2.2.1 ApoE-/-小鼠肩胛區脂肪細胞HE染色 “內消軟脈湯”低劑量組、“內消軟脈湯”高劑量組小鼠的肩胛脂肪具有細胞體積縮小、細胞數目增多、細胞HE染色較深等棕色脂肪細胞的表現，且這種表現隨著“內消軟脈湯”劑量增加而更加明顯。結果如圖1所示。

2.2.2 ApoE-/-小鼠腹股溝處脂肪細胞組織HE染色 空白組、模型組、“內消軟脈湯”低劑量組、“內消軟脈湯”低劑量組高劑量組的脂肪細胞體積逐漸變小、表現為分隔增多的多房室結構脂泡、HE染色逐漸變深、細胞核著色逐漸增多，高倍顯微鏡下單位視野見脂肪細胞數目逐漸增多。結果如圖2所示。

2.2.3 ApoE-/-小鼠附睪區HE染色 空白組、模型組、“內消軟脈湯”低劑量組、“內消軟脈湯”低劑量組小鼠的附睪區脂肪的細胞體積、細胞數目未見顯著差異。結果如圖3所示。

2.3 “內消軟脈湯”對ApoE-/-小鼠肩胛區、腹股溝區及附睪區UCP1蛋白表達的影響

用Western blot法對ApoE-/-小鼠肩胛區、腹股溝區及附睪區的UCP1蛋白表達量進行檢測。模型組、“內消軟脈湯”低劑量組、“內消軟脈湯”高劑量組的肩胛區、腹股溝區的UCP1蛋白表達量依次增加。ApoE-/-小鼠肩胛區、腹股溝區及附睪區UCP1蛋白在模型組的表達量與空白組比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)。ApoE-/-小鼠肩胛區、腹股溝區及附睪區UCP1蛋白的表達量與模型組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見表2，圖4、圖5、圖6。

表2 各組ApoE-/-小鼠肩胛區、腹股溝區及附睪區UCP1蛋白表達的比較

注：A.空白組；B.模型組；C.內消軟脈湯低劑量組；D.內消軟脈湯高劑量組。

注：A.空白組；B.模型組；C.內消軟脈湯低劑量組；D.內消軟脈湯高劑量組。

注：A.空白組；B.模型組；C.內消軟脈湯低劑量組；D.內消軟脈湯高劑量組。

注：A.空白組；B.模型組；C.內消軟脈湯低劑量組；D.內消軟脈湯高劑量組。

注：A.空白組；B.模型組；C.內消軟脈湯低劑量組；D.內消軟脈湯高劑量組。

注：A.空白組；B.模型組；C.內消軟脈湯低劑量組；D.內消軟脈湯高劑量組。

3 討論

實驗結果表明，“內消軟脈湯”可以降低ApoE-/-小鼠甘油三酯水平，并使ApoE-/-小鼠的肩胛區、腹股溝區及附睪區的脂肪組織活化增加，說明“內消軟脈湯”可以激活棕色脂肪組織，并可以使白色皮下及內臟脂肪組織棕色化，其中白色內臟脂肪組織(附睪區脂肪組織)棕色化的程度小于白色皮下脂肪組織(腹股溝區脂肪組織)。根據實驗結果，小鼠脂肪組織UCP1的表達隨“內消軟脈湯”劑量的增加而具有增加趨勢，說明此方可激活UCP1依賴性皮下脂肪活化。

小鼠TG及炎癥水平的降低可能均與脂肪組織活化有關。既往研究表明，當脂肪組織活化時，腺苷酸環化為cAMP，激活cAMP依賴蛋白激酶，促進激素敏感性甘油三酯脂肪酶(hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL)和細胞質中脂滴包被蛋白1的磷酸化，后者激活脂肪組織內甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)，最終在這些酶的作用下，甘油三酯分解為甘油及脂肪酸[12]，脂肪酸可出細胞并由血漿清蛋白運輸至全身利用，而存在于胞內的脂肪酸則可進一步激活UCP1的活性以促進后期UCP1介導的產熱作用。棕色脂肪細胞內富含脂肪酸結合蛋白3(fatty acid binding protein 3，FABP3)，甘油三酯分解產生胞內脂肪酸在細胞質內與FABP3結合被轉運至線粒體內部[13]，進行脂肪酸的β氧化，棕色脂肪細胞線粒體內富含UCP1，可在線粒體內膜上形成質子通道，使內膜細胞質側的氫質子直接由此通道返回線粒體基質，由于影響了原本氫離子電化學梯度回流而促使釋放勢能的過程，從而使得氧化與磷酸化解偶聯，最終不產生ATP而由熱能直接釋放[14-15]，減少了脂類物質的儲存，棕色脂肪組織活化產熱嚴格依賴于UCP1[16]，故UCP1是控制肥胖的重要靶點，可使得脂肪活化小鼠的TG水平得以下降。小鼠膽固醇水平的降低機制可能于棕色脂肪細胞活化后提升了膽固醇酯轉移蛋白活性，使富含TG的脂蛋白代謝后的殘粒向高密度脂蛋白轉移增加，從而使膽固醇逆向轉運途徑效率增加有關[17]；還可能于產熱脂肪細胞膜活化后，脂肪細胞數量增加，使機體利用膽固醇合成細胞膜增加有關，但具體機制尚需進一步研究。

有研究證據表明，棕色脂肪組織的活化產熱嚴格依賴UCP1[12]，另外，激活白色脂肪組織可使之轉化成棕色樣脂肪組織，或稱為米色脂肪(beige)激活，從而發揮產熱作用，這一過程同樣也依賴UCP1[13]。由此可見，UCP1的激活機制是調控脂肪組織代謝的關鍵環節，也是研究新型降脂藥物的重要靶點。

中醫學認為，血脂異常的表現多與“痰”相關[18]，過食肥甘厚味損傷脾運而生痰，或素體脾虛，脾失健運，致痰蘊體內，痰濕體質是體內膏脂偏多[19]，是代謝紊亂性疾病如脂質代謝異常發生的重要生理病理基礎，運用化痰法可改善血脂異常的狀態，“內消軟脈湯”以二陳湯之陳皮、茯苓、姜半夏燥濕健脾化痰；以白僵蠶、浙貝母、海藻、昆布、橘核、炒白芥子化痰散結，又兼生黃芪、靈芝以健脾益氣，扶助正氣，助脾胃運化，以絕生痰之源，可通過多方面改善人體血脂異常的狀態。“炎癥”的成因與性質與中醫學中“毒邪”的理論頗為相似，許多研究表明，具有清熱解毒作用的單味中藥及中藥復方均可抑制炎癥[20]，“內消軟脈湯”中以天花粉、夏枯草、玄參、金銀花、黃連清熱解毒，結合白芷、香附、薄荷，配和僵蠶可升陽中之清陽；姜黃可降陰中之濁陰，一升一降，可以暢通身體內外之氣機，可使雜氣之流毒頓消。

高脂血癥及代謝性炎癥對人體健康危害極大，中醫藥對于這類疾病的治療具有獨特的優勢，目前，對于“化痰散結法”的研究已有不少，但對于其具體作用機制的研究不足，“內消軟脈湯”作為“化痰散結法”典型方劑，若能明確其作用機制，將會對于開拓中醫藥治療心腦血管的新思路，尋找中醫藥防治高脂血癥及代謝性炎癥的新靶點，繼而進一步提高臨床療效，具有重要意義。