口腔鱗癌Survivin 表達的臨床意義與PCNA 關系研究*

于肖鵬 李曉光 蘇慶琪 劉 桐 李騰宇 王延秀

口腔鱗狀細胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是目前臨床上常見的惡性腫瘤，現階段治療此病的最有效方法仍然是腫瘤手術切除，現在其預后不良的原因主要是腫瘤發生淋巴結轉移及局部復發[1]，其轉移復發的原因之一是OSCC 細胞的惡性增殖。Survivin 基因既有抑制腫瘤細胞凋亡作用，還有調節腫瘤細胞周期的有絲分裂作用，其具有的雙重功能成為目前研究的熱點[2]。增殖細胞核抗原(Pr oliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)作為DNA 聚合酶的一種輔助性蛋白，能夠反應出細胞的生長增殖情況[3，4]。本研究課題通過免疫組化的實驗方法，測定PCNA 和Survivin 蛋白在口腔鱗癌中的表達，研究Survivin 表達的意義，以及與PCNA 表達的相關性。

1.材料與方法

1.1 臨床資料及切片制備 OSCC 標本共106例，來自2007 年1月至2017 年12月我院頜面外科病房手術切除組織，患者年齡34～78 歲，平均60.6 歲，其中女性41 例，男性65 例。根據術后病理檢查結果判斷頜頸部的淋巴結是否發生轉移。10 例正常口腔黏膜，取自口腔黏膜外傷組織。選取的106 例患者術前均未進行化學治療或放射治療，臨床分期按照TNM 國際統一分期方法(UICC)分組，其中Ⅰ期14 例，Ⅱ期為29 例，Ⅲ期38 例，Ⅳ期為25 例。組織病理學分級為：1 級33 例，2 級為51 例，3 級為22 例。具體腫瘤部位為：舌癌41例，牙齦癌為30 例，頰癌13 例，硬腭癌為8 例，口底癌14 例。免疫組化染色方法采用抗PCNA 和Survivin 單克隆抗體，分別對OSCC 切片染色。同時進行常規HE 染色。

1.2 免疫組織化學染色 染色試劑DAB 由Sigma 公司提供，PCNA 及Survivin 單克隆抗體由武漢博士德公司提供。按照試劑說明以SABC免疫組織化學法常規操作。陽性對照分別用已知Survivin 及PCNA 陽性的乳腺癌切片作對照，陰性對照采取第一抗體用PBS 替代作對照，用DAB顯色，再用蘇木精復染。

1.3 Survivin 蛋白表達的判斷標準 腫瘤細胞質內含有棕褐色樣顆粒即視為陽性染色(圖1)。每張切片有10%以上的癌細胞表現為弱、中等著色強度[5]，即判斷為Survivin 表達陽性。

圖1 Survivin 陽性細胞漿內含有棕色顆粒(免疫組化DAB 染色×400)

1.4 PCNA 標記指數(PCNA Label index，PLI)的計算方法 腫瘤細胞核有棕褐色染色即視為PCNA染色陽性(圖2)。選取500 個腫瘤細胞計數其中PCNA 陽性細胞數量，其所占百分數則為PLI。

圖2 PCNA 陽性細胞核內含有棕褐色顆粒(免疫組化DAB 染色×400)

1.5 統計學分析 實驗數據采用SPSS17.0 統計學軟件包分析，Survivin 表達與PLI 和臨床因素關系的判斷使用卡方檢驗。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 Survivin 的表達及PLI 檢測結果 74 例腫瘤組織Survivin 染色呈陽性，陽性率為69.81%。正常口腔黏膜組織中無表達，二者差異顯著(X2=19.28，P＜0.01)。PLI 值為16.1%～96.2%，平均值為(55.01±22.02)%，以PLI 平均值分為低56 例(16.1%～56.15%)、高50 例(56.15%～96.2%)兩組進行統計分析。

2.2 腫瘤組織中Survivin 蛋白表達與病理因素關系 Survivin 的蛋白表達量與OSCC 的淋巴結轉移、病理分級和TNM 分期密切相關(P＜0.01)，見表1。

表1 Survivin 表達與臨床病理因素的關系(例數)

2.3 腫瘤組織中Survivin 表達與PCNA 的關系 Survivin 表達陽性的口腔鱗狀細胞癌組，其PLI 值明顯高于Survivin 表達陰性組，兩者表達明顯正相關(P＜0.01)，結果見表2、圖3、圖4。

表2 Survivin 表達與PCNA 的關系

圖3 Survivin 表達與PLI 值高低線圖

圖4 Survivin 表達與PLI 值高低線圖

3.討論

在細胞的DNA 中，存在著凋亡基因及抑制凋亡基因，正常情況下，兩者處于平衡協調狀態，維護著細胞的生死秩序。目前發現的眾多凋亡抑制因子中，Survivin 是作用最強的因子，在人類所有腫瘤組織中，幾乎都發現了其表達，它可以抑制多種細胞凋亡基因誘導的腫瘤凋亡，通過抑制抗癌藥物的凋亡誘導，降低藥效[6]，且促使惡性腫瘤細胞的生長增殖。Survivin 在細胞增殖G2/ M 期選擇性表達，同時具有細胞周期的特異性，在細胞的有絲分裂期，紡錘軸的微管可以與Survivin 進行結合，而微管的運動又可以調節Survivin 的表達水平，Survivin 過度表達時，就很難與結合的微管分離，這時候就可以出現其持續的抗凋亡效果。由此認為在細胞G2/ M 期，Survivin 通過抑制凋亡誘導，促進細胞的異常生長增殖[7]。多項報道認為其可作為腫瘤預后不良的標志[8-10]。

本結果表明，其Survivin 蛋白表達陽性率是69.81%，在高分化組是48.48%，而中低分化組高達79.45%，兩組之間差異顯著(P＜0.01)，說明隨著腫瘤分化程度降低，Survivin 的凋亡抑制作用更強，表達與病理分級相關。同時Survivin 表達和臨床分期也相關(P＜0.01)，在口腔鱗癌發病的后期其表達更強。本組Survivin 表達陽性患者，其頸部淋巴結發生轉移的機率大于陰性者(P＜0.01)，二者密切相關，同多數其他學者研究相似[11，12]。由此說明Survivin 的過高表達可以抑制細胞凋亡，促進腫瘤的無限制生長。腫瘤發生死亡的原因約85%～95%是其轉移引起[13]，臨床研究顯示口腔鱗癌晚期更易出現轉移，且與腫瘤的大小相關[14]。說明檢測口腔鱗癌Survivin 蛋白的表達對預后判斷有明顯指導作用，靶向Survivin 基因治療，將提供口腔癌治療的新途徑。

PCNA 蛋白的表達與細胞的生長增殖周期一致[15]，常作為細胞增殖生長活性的指標[4，16]。已有多項臨床及動物實驗研究提示，PCNA 表達與口腔癌的病理分型和頸部淋巴結轉移關系密切[17，18]，可以作為其預后的指標之一。本項研究表明在Survivin表達陽性者中，PLI 值明顯高于陰性者，差異顯著(P＜0.01)，兩者的表達明顯相關，說明Survivin蛋白一方面調控腫瘤凋亡，同時促進腫瘤增殖。目前口腔癌治療的最有效方法仍然是手術切除，本項研究提示腫瘤切除標本若survivin 和PCNA 都陽性表達，表明預后不良，應該進行術后放療和鞏固性治療，并且術后密切隨訪。手術前在進行腫物活檢時，建議同時進行survivin 和PCNA 檢測，陽性者應考慮進行根治性切除。