HPLC 法測(cè)定特醫(yī)食品基暢中谷氨酰胺的含量

柳 俊 李漢西 黃琪評(píng) 曾德猷 盧韻君

（廣州紐健生物科技有限公司，廣東廣州 510663）

在各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中，除市面上常見(jiàn)的“小藍(lán)帽”保健食品外，特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品（簡(jiǎn)稱(chēng)特醫(yī)食品） 也逐漸受到重視。特醫(yī)食品是指為滿(mǎn)足進(jìn)食受限、消化吸收障礙、代謝紊亂或者特定疾病狀態(tài)人群對(duì)營(yíng)養(yǎng)素或者膳食的特殊需求，專(zhuān)門(mén)加工配制而成的配方食品，其主要針對(duì)的人群是臨床患者。

特醫(yī)食品（基暢） 是廣州紐健生物科技有限公司自主研發(fā)的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品，主要用于放化療引起的腸道黏膜損傷，腸外營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致的腸道黏膜萎縮以及一般性腹瀉、便秘等。產(chǎn)品配方主要由小麥低聚肽、聚葡萄糖及低聚果糖等營(yíng)養(yǎng)素組成，其中小麥低聚肽富含谷氨酰胺。谷氨酰胺是一種特殊的氨基酸，由于多一個(gè)酰胺基，使其成為體內(nèi)氮的運(yùn)載體。谷氨酰胺是人體必需氨基酸，具有促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)合成、保持小腸黏膜正常結(jié)構(gòu)和功能，增強(qiáng)免疫反應(yīng)等作用。體外試驗(yàn)表明谷氨酰胺對(duì)胃腸黏膜損傷具有保護(hù)和修復(fù)作用。

目前，對(duì)于特醫(yī)食品中谷氨酰胺的含量檢測(cè)鮮有報(bào)道，為了更好地控制和提升產(chǎn)品質(zhì)量，本試驗(yàn)針對(duì)特醫(yī)食品基暢，建立了高效液相色譜法測(cè)定特醫(yī)食品基暢中谷氨酰胺含量的分析方法，以期為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

L-谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)140705-201403，中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈，色譜純；辛烷磺酸鈉、磷酸，分析純；蒸餾水，雙蒸水；腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)食品基暢，廣州紐健生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

UltiMate3000 系列高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技公司；BSA223S 電子分析天平；UV-250 分光光度計(jì)，日本島津。

1.3 方法

1.3.1 色譜測(cè)定條件

Hypersil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：辛烷磺酸鈉溶液∶乙腈（95∶5）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：27 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精確稱(chēng)取適量對(duì)照品L-谷氨酰胺，置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容。

1.3.3 供試品溶液的制備

精確稱(chēng)取供試品約0.2 g，置于100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，過(guò)濾，取濾液，即得供試品溶液。臨用前，用孔徑0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾。

1.3.4 陰性供試品溶液的制備

按產(chǎn)品工藝過(guò)程制備不含小麥低聚肽的產(chǎn)品，參照“1.3.3”方法制備陰性供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜測(cè)定方法的選擇

取L-谷氨酰胺對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示L-谷氨酰胺在波長(zhǎng)210 nm 處有強(qiáng)吸收峰，因此選定210 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。通過(guò)參考文獻(xiàn)調(diào)研，以及試驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)多種流動(dòng)相條件進(jìn)行對(duì)比，最后選定辛烷磺酸鈉溶液（取辛烷磺酸鈉0.865 g，加1 000 mL 水溶解，再加0.5 mL 磷酸，混勻） ∶乙腈=95∶5 為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min。

2.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

在上述色譜條件下對(duì)陰性供試品溶液進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在谷氨酰胺相同的保留時(shí)間處基本無(wú)色譜峰，說(shuō)明陰性樣品對(duì)所測(cè)組分無(wú)干擾。HPLC 色譜圖見(jiàn)圖1～圖3。

2.3 線(xiàn)性試驗(yàn)

分別對(duì)不同質(zhì)量濃度谷氨酰胺對(duì)照品溶液（0.1 mg/mL，0.3 mg/mL，0.5 mg/mL，0.7 mg/mL，1.0 mg/mL） 進(jìn)行色譜測(cè)定，按上述色譜條件測(cè)定峰面積積分值，并以峰面積積分值（Y） 對(duì)谷氨酰胺含量（X） 進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=29.178 3x+0.308 6，R2=0.999 9。

圖1 谷氨酰胺對(duì)照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

圖3 陰性供試品色譜圖

表明谷氨酰胺在2.0 μg～20.0 μg 質(zhì)量范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 谷氨酰胺對(duì)照品測(cè)定結(jié)果

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液（0.7 mg/mL） 20 μL 重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得峰面積積分值RSD 為0.04%，表明精密度良好。

2.5 重復(fù)度試驗(yàn)

取同一批號(hào)的供試品，按“1.3.3”方法操作，平行制備6 份供試品溶液，按色譜條件測(cè)定，測(cè)得谷氨酰胺平均含量為199.78 mg/g，RSD 為1.14%，表明分析方法的重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱(chēng)取供試品約0.2 g，按“1.3.3”方法操作制備供試品溶液，取同一供試品溶液各20 μL，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h 按上述色譜條件測(cè)定，測(cè)得峰面積積分值RSD 為0.05%，表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精確稱(chēng)取已知含量供試品（谷氨酰胺含量200 mg/g） 約1 g，按“1.3.3”方法操作制備供試品溶液。吸取供試品溶液9 份，每份4 mL，分別置于100 mL 容量瓶中，1～3 號(hào)容量瓶中各添加谷氨酰胺對(duì)照品6.4 mg，4～6 號(hào)容量瓶中各添加谷氨酰胺對(duì)照品8.0 mg，7～9 號(hào)容量瓶中各添加谷氨酰胺對(duì)照品9.6 mg，然后按“1.3.3”中供試品溶液的制備方法處理，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示平均回收率為99.22%，RSD 為1.06%，證明該方法回收率較好，準(zhǔn)確度較高。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 耐用性試驗(yàn)

本試驗(yàn)考察波長(zhǎng)、流速、溫度、流動(dòng)相比例發(fā)生微小變化時(shí)對(duì)谷氨酰胺含量測(cè)定的影響。

波長(zhǎng)：考察208 nm、212 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)變化對(duì)谷氨酰胺含量檢測(cè)的影響。

流速：考察0.8 mL/min、1.2 mL/min 流速對(duì)谷氨酰胺含量檢測(cè)的影響。

溫度：考察26.5 ℃、27.5 ℃溫度對(duì)谷氨酰胺含量檢測(cè)的影響。

流動(dòng)相比例變化：考察流動(dòng)相比例（辛烷磺酸鈉溶液∶乙腈=98∶2、92∶8） 對(duì)檢測(cè)的影響程度。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同色譜條件下，谷氨酰胺含量檢測(cè)值RSD 為0.39%，表明當(dāng)色譜條件發(fā)生微小變化時(shí)，對(duì)本品含量測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響。因此，認(rèn)為本方法耐用性良好，滿(mǎn)足含量測(cè)定要求。

3 結(jié)論

特醫(yī)食品（基暢） 主要用于放化療引起的腸道黏膜損傷，腸外營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致的腸道黏膜萎縮以及一般性腹瀉、便秘等。谷氨酰胺是基暢中主要功效營(yíng)養(yǎng)成分之一，其對(duì)胃腸黏膜損傷具有保護(hù)和修復(fù)作用。因此，利用HPLC 法準(zhǔn)確測(cè)定基暢中谷氨酰胺的含量，有利于進(jìn)一步確保產(chǎn)品質(zhì)量的可靠性。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，谷氨酰胺在2.0 μg～20.0 μg 質(zhì)量范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系，R2=0.999 9；該方法的精密度RSD 為0.04%；重復(fù)性RSD 為1.14%；穩(wěn)定性RSD為0.05%；加樣回收率RSD 為1.06%，耐用性RSD為0.39%。試驗(yàn)結(jié)果表明高效液相法測(cè)定特醫(yī)食品基暢中谷氨酰胺含量的方法科學(xué)可行。