韭菜兩新優品種葉片游離氨基酸總量測定與比較

張 偉,馬培芳,李延龍,王雅麗,王繼蕓,張華敏,陳建華, 尹守恒,李克寒

(河南省韭菜工程技術研究中心/平頂山市農業科學院，河南 平頂山 467001)

氨基酸是蛋白質的組成基本單位，是人體必需的營養。而韭菜葉片中富含游離氨基酸是用來描述韭菜葉片營養價值的一個重要品質指標。韭菜主食葉片，進行游離氨基酸總量的測定是對韭菜葉片氨基酸營養的確定。航研998與平韭2號都是比較新出的品種，所以以這兩個品種作為實驗材料。

游離氨基酸與水合茚三酮反應，產生二酮茚—二酮茚胺藍紫色化合物。在一定范圍內，顏色的深淺與游離氨基酸含量成正比，可以用紫外可見分光光度計，在570 nm下測得藍紫色溶液的吸光度，然后根據標準曲線計算樣品中游離氨基酸的含量。

1 材料和方法

1.1 實驗材料、儀器和試劑。

1.1.1 材料 新鮮韭菜葉片

1.1.2 儀器 主要有:

(1)研缽、漏斗、三角瓶、濾紙 、容量瓶(50 mL, 100 mL);

(2)橡膠塞刻度試管50 mL;

(3)移液槍200 μL、1 000 μL、5 000 μL;

(4)沸水浴電磁爐;

(5)UV-1600紫外可見分光光度計;

(6)分析天平。

1.1.3 試劑 主要有:

(1)10%乙酸。

(2)水合茚三酮試劑：稱取0.6 g茚三酮加入15 mL正丙醇，再加入30 mL正丁醇及60 mL乙二醇溶解，最后在加入9 mL pH5.4乙酸—乙酸鈉緩沖液，混勻，貯于250 mL 廣口棕色瓶于冰箱冷藏室內保存，10 d內有效。

(3)乙酸—乙酸鈉緩沖液(pH5.4)：稱取32.56 g乙酸鈉(NaAc)，加入超純水加熱至沸，冷卻后加30 mL冰乙酸，用超純水定容至100 mL。

(4)氨基酸標準液：稱取80℃烘干的L-亮氨酸(生物技術級)46.8 mg，以10%異丙醇溶解，并定容至100 mL，取此液5 mL用超純水稀釋至50 mL，即為每毫升含氨基氮5 ug的標準液。

(5)0.1%的抗壞血酸：50 mg溶于50 mL超純水中，現用現配。

(6)60%乙醇[1]。

1.2 操作步驟

1.2.1 標準曲線制作 取6支50 mL刻度試管，按表1加入試劑后，混勻，蓋上橡膠塞，置沸水浴中15 min，然后取出在冷水浴中迅速冷卻，直到溶液呈藍藍紫色時，用60%乙醇定容至20 mL，搖勻，在570 nm下測吸光度。

表1 標準曲線的吸光度測定

表2 吸光度的計算

1.2.2 樣品提取 新鮮葉片擦干凈，取中部剪碎，稱0.15 g，于研缽中加10%乙酸1.5 mL，研磨，轉移至25 mL容量瓶中，用超純水定容，然后在用干濾紙過濾至三角瓶中。

1.2.3 樣品測定 樣品濾液1 ml吸入20 mL具塞刻度試管中，加超純水1 mL，水合茚三酮3 mL，0.1%抗壞血酸0.1 mL，顯色、比色同標準曲線方法。并根據吸光度在標準曲線位置上計算出樣品的含氮量X(ug)。

2 結果與分析

按照下式計算出100 g鮮樣中氨基態氮的含量：

氨基態氮含量(mg·100g-1鮮樣)=

2.1 實驗結果

實驗結果如表2。

表4 平韭2號與航研998的不同收割天數與每百克葉片的氨基態氮計算結果

2.2 結果分析

從實驗結果看，航研998的百克葉片中游離氨基酸總量比平韭2號的多，也可以認為其游離氨基酸總量營養價值比平豐2號較高。在收割時比較航研998長勢比平韭2號強許多，直立性好，分蘗性強。總之航研998與平韭2號在各方面相比較表現出來的是一個好品種。

3 討 論

由于蛋白質和多肽中的游離氨基酸也會產生茚三酮的還原反應，因此，對于含大量蛋白質和多肽的樣品，可以先用蛋白質沉淀劑將其除去。常用的蛋白質沉淀劑有10%乙酸，且乙酸提取總氨基酸的效果較好。

(1)實驗用水為超純水，若無可用無氨蒸餾水代替。

(2)實驗中以抗壞血算為還原劑，可提高反應的靈敏度，并使顏色穩定，由于抗壞血酸可與茚三酮反應，使溶液顏色過深，需要掌握加入抗壞血酸的量，而且抗壞血酸必須現用現配。

(3)該反應需要脫水縮合，反應介質中水的多少不但對終點產物的濃度有很大影響，而且還會影響終點產物的穩定性[2]。因此，反應完后在反應中加入定量60%乙醇，用來穩定反應產物。

(4)水合茚三酮與氨基酸反應所生成的二酮茚—二酮茚胺在1h內是穩定的，故顯色后的溶液加入60%乙醇稀釋后盡快比色。