高效液相色譜法測(cè)定飼料添加劑25-羥基維生素D3 含量的方法研究

趙小陽(yáng)，虞哲高，張 進(jìn)，何 雷

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081；2.帝斯曼（中國(guó)）有限公司，上海 201203）

維生素D3是一種具有多種生理功能的類(lèi)固醇類(lèi)激素，天然形式的維生素D3不具有生物活性，其活性形式為1α,25-二羥基維生素D3。維生素D3首先在肝臟經(jīng)25-羥基酶作用下，脫氫生成25-羥基維生素D3，然后在腎臟中經(jīng)1α羥化酶羥化生成1α,25-二羥基維生素D3[1]。25-羥基維生素D3是維生素D3的第一個(gè)代謝產(chǎn)物，也是維生素D3在血液循環(huán)中的主要活性形式，其生物效價(jià)是維生素D3的3～5 倍[2]。動(dòng)物通過(guò)采食飼料中的25-羥基維生素D3，吸收后可在血液中獲得25-羥基維生素D3，繞開(kāi)肝臟的羥化反應(yīng)，能更有效地轉(zhuǎn)化成最終生物活性代謝物[3]。在飼料中添加一定量的25-羥基維生素D3，可調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)的鈣磷平衡，維持骨骼健康，改善免疫功能，調(diào)節(jié)能量代謝，并在提高畜禽生產(chǎn)性能、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)方面也有一定作用[2]。歐盟于2005 年批準(zhǔn)25-羥基維生素D3作為飼料添加劑用于禽，于2009 年批準(zhǔn)了25-羥基維生素D3作為飼料添加劑用于豬。研究表明，在仔豬的耐受性試驗(yàn)中，仔豬飼糧中添加推薦量5～10 倍的25-羥基維生素D3不影響其生理指標(biāo)[4]。25-羥基維生素D3是一種安全系數(shù)較高的飼料添加劑[2]，我國(guó)農(nóng)業(yè)部（現(xiàn)為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，下同）第2045 號(hào)公告中將其列入《飼料添加劑品種目錄（2013）》，準(zhǔn)許用于豬和家禽飼料中。2017 年農(nóng)業(yè)部的2625 號(hào)文規(guī)定了25-羥基維生素D3在配合飼料和全混合日糧中的最高限量。近年來(lái)，25-羥基維生素D3在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用，除進(jìn)口25-羥基維生素D3飼料添加劑外，我國(guó)目前已有幾家企業(yè)生產(chǎn)該產(chǎn)品，但我國(guó)目前尚未有飼料添加劑25-羥基維生素D3產(chǎn)品的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。本文采用高效液相色譜法測(cè)定飼料添加劑25-羥基維生素D3含量，以期為飼料添加劑25-羥基維生素D3的含量測(cè)定提供操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備 電子分析天平：感量0.1 mg 和0.01 mg，德國(guó)Sartorius 公司；數(shù)顯控溫水浴鍋：精度0.1℃，超聲波水浴清洗器，功率280 W，德國(guó)IKA 公司；離心機(jī)：12 000 r/min，美國(guó)Thermo 公司；高效液相色譜儀：配有紫外可調(diào)波長(zhǎng)檢測(cè)器或二極管矩陣檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 1200。

1.2 試劑和溶液 甲醇：色譜純，購(gòu)于Fisher Scientific公司；甲醇：國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭凰悍稀斗治鰧?shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》（GB/T 6682-2008）標(biāo)準(zhǔn)，一級(jí)。80%甲醇溶液：400 mL 甲醇，用水稀釋至500 mL，混勻。25-羥基維生素D3一水化合物對(duì)照品（CAS：63283-36-3，純度≥98.0%），購(gòu)于Dr.Ehrenstorfer 公司。

25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：稱(chēng)取25-羥基維生素D3一水化合物對(duì)照品25 mg（精確至0.01 mg）于25 mL 的棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。溶液保存于-20℃冰箱。

25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)貯備液5.0 mL 于50 mL 的棕色容量瓶中，用80%甲醇溶液定容。臨用時(shí)現(xiàn)配。

1.3 方法

1.3.1 25-羥基維生素D3含量的測(cè)定

1.3.1.1 試樣溶液的制備 稱(chēng)取1 g試樣（精確至0.000 1 g），置于100 mL 的棕色容量瓶中。在容量瓶中加入20 mL水，搖勻后在超聲波水浴中超聲處理20 min，用甲醇定容。搖勻后取適量于離心機(jī)上，以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，上清液用0.2 μm 濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜儀分析。

1.3.1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18柱，長(zhǎng)150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm；流動(dòng)相：甲醇+水=80+20；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.1.3 轉(zhuǎn)換系數(shù)F 的測(cè)定 在一定溫度下，少量的25-羥基維生素D3會(huì)轉(zhuǎn)化為預(yù)25-羥基維生素D3，這一性質(zhì)與維生素D3的性質(zhì)有類(lèi)似之處。在生產(chǎn)、儲(chǔ)存和檢測(cè)過(guò)程中，飼料添加劑25-羥基維生素D3產(chǎn)品中會(huì)有部分的預(yù)25-羥基維生素D3由25-羥基維生素D3轉(zhuǎn)化而來(lái)，正如在飼料添加劑維生素D3的產(chǎn)品中，會(huì)有部分的預(yù)維生素D3存在一樣。在維生素D3產(chǎn)品中，現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[5-6]以維生素D3和預(yù)維生素D3的含量之和作為產(chǎn)品中維生素D3的總量。在飼料添加劑25-羥基維生素D3產(chǎn)品中，25-羥基維生素D3總量以25-羥基維生素D3和預(yù)25-羥基維生素D3的含量之和來(lái)表示。由于得不到商品化的預(yù)25-羥基維生素D3的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，預(yù)25-羥基維生素D3的含量通過(guò)轉(zhuǎn)換系數(shù)F 來(lái)計(jì)算，計(jì)算公式：

具體測(cè)定方法及字母代表的含義如下：將1 mL 的25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)工作溶液裝入進(jìn)樣小瓶，將20 μL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入高效液相色譜儀，得到25-羥基維生素D3的色譜峰。測(cè)定的25-羥基維生素D3的峰面積記為A。如果在色譜圖中有預(yù)25-羥基維生素D3色譜峰，預(yù)25-羥基維生素D3的峰面積記為Apre。

取5 mL 的25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)工作溶液倒入具有螺旋瓶蓋的10 mL 螺口試管中，旋緊瓶蓋，置于50℃恒溫水浴中，放置3 h 后取出，冷卻至室溫后將試管內(nèi)的溶液取1 mL 裝入進(jìn)樣小瓶，將20 μL 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入高效液相色譜儀，得到25-羥基維生素D3的色譜峰和預(yù)25-羥基維生素D3色譜峰（圖1）。25-羥基維生素D3的峰面積記為A*，預(yù)25-羥基維生素D3的峰面積記為Apre*。

1.3.1.4 分析結(jié)果的表述 試樣中25-羥基維生素D3的含量計(jì)算公式如下：

圖1 25-羥基維生素D3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液經(jīng)50℃加熱后色譜圖

式中，X1為試樣中25-羥基維生素D3的含量，單位為%；F 為25-羥基維生素D3與預(yù)25-羥基維生素D3峰面積的轉(zhuǎn)換系數(shù)；Aspre為樣品溶液中預(yù)25-羥基維生素D3峰面積；As 為樣品溶液中25-羥基維生素D3峰面積；Apre為25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中預(yù)25-羥基維生素D3峰面積；A 為25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中25-羥基維生素D3峰面積；C 為25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度，單位為μg/mL；m 為樣品的質(zhì)量，單位為g。

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.4.1 方法的檢測(cè)限和定量限 分析方法的檢測(cè)限LOD 和定量限LOQ 由信噪比（S/N）計(jì)算。LOD 定義為S/N=3時(shí)對(duì)應(yīng)的待分析物濃度，LOQ 定義為S/N=10 時(shí)對(duì)應(yīng)的待分析物濃度。將25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液用80%甲醇溶液稀釋?zhuān)?dāng)25-羥基維生素D3的濃度為0.18 μg/mL，軟件計(jì)算得到的S/N=2.7。按樣品的取樣量及稀釋體積計(jì)算，方法的檢測(cè)限為0.018 mg/g。當(dāng)25-羥基維生素D3的濃度為0.52 μg/mL，軟件計(jì)算得到的S/N=9.7。按樣品的取樣量及稀釋體積計(jì)算，方法的定量限為0.052 mg/g。

1.4.2 方法的線(xiàn)性范圍 取25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)貯備液用80% 甲醇溶液稀釋?zhuān)渲葡盗袠?biāo)準(zhǔn)工作液，最終濃度分別為3.014、6.028、9.042、18.084、60.280、90.470、150.700 μg/mL。系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣20 μL，按所述色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明25-羥基維生 素D3在3.0～150.7 μg/mL 濃度范 圍內(nèi)峰面積（Y）與濃度（X）線(xiàn)性相關(guān)性良好。回歸線(xiàn)性方程為Y=48.8246X+0.7358，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r=1.000。

1.4.3 精密度試驗(yàn) 按1.3.1 試樣溶液的制備方法，稱(chēng)取標(biāo)示量為1.25% 的飼料添加劑25-羥基維生素D3的試樣6 份，按色譜條件檢測(cè)樣品的含量，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%。25-羥基維生素D3試樣的6 次測(cè)試的含量均值為1.28%（1.26%～1.29%），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（0.91%）小于1%，表明該方法有較好的精密度。

1.4.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取約0.4 g 同一批次的飼料添加劑25-羥基維生素D3樣品9 份，置于100 mL 的棕色容量瓶中。該批次樣品的本底值為1.28%。在容量瓶加入20 mL 水，搖勻后在超聲波水浴中超聲處理20 min。將試樣分為3 組，每組3 份。于每組中分別精確加入25-羥基維生素D3的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液（濃度為1.056 mg/mL）2.5、5.0、10.0 mL，在容量瓶中加入50 mL 甲醇，在超聲波水浴中超聲處理20 min 后用甲醇定容至刻度，搖勻后取適量于離心機(jī)上，以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，上清液用0.2 μm 濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜儀分析。從表1 中可以看出，在不同添加水平下，回收率范圍為96.97%～101.23%，平均回收率為98.19%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%。

表1 加標(biāo)回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將配制好的樣品溶液置于棕色的進(jìn)樣小瓶中，每隔1 h 進(jìn)樣一次，連續(xù)進(jìn)樣12 h。試驗(yàn)結(jié)果顯示，12 h 內(nèi)峰面積變化不大，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%，表明12 h 內(nèi)，25-羥基維生素D3在避光條件下穩(wěn)定。將樣品溶液置于透明的進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi)，在光照條件下放置12 h 后測(cè)定，發(fā)現(xiàn)25-羥基維生素D3的含量有一定程度的下降，表明25-羥基維生素D3在光照條件下不穩(wěn)定，因此在操作中應(yīng)注意樣品的避光。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)換系數(shù)F 如表2 所示，溫度的高低不影響轉(zhuǎn)換系數(shù)F 值的大小。將標(biāo)準(zhǔn)溶液在90℃水浴中回流45 min和標(biāo)準(zhǔn)溶液在50℃水浴中放置3 h 得到的轉(zhuǎn)換系數(shù)F 值分別為2.18 和2.21。由于將標(biāo)準(zhǔn)溶液在50℃水浴中放置的操作更簡(jiǎn)便，因此在分析方法中采用了標(biāo)準(zhǔn)溶液在50℃水浴中放置3 h 的方法來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)換系數(shù)F 值。

表2 轉(zhuǎn)換系數(shù)F 的測(cè)定

2.2 實(shí)際樣品的測(cè)定 7 個(gè)批次飼料添加劑25-羥基維生素D3產(chǎn)品來(lái)源于幾家生產(chǎn)商，這7 批次樣品按照1.3.1試樣溶液的制備方法操作，得到樣品溶液中25-羥基維生素D3的濃度不同，但均在測(cè)定的線(xiàn)性范圍之內(nèi)，結(jié)果見(jiàn)表3。原因可能在于飼料添加劑25-羥基維生素D3標(biāo)示量沒(méi)有統(tǒng)一規(guī)定，不同生產(chǎn)商會(huì)提供不同規(guī)格的產(chǎn)品。

表3 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果 %

飼料添加劑25-羥基維生素D3是以化學(xué)合成制備法制得的25-羥基維生素D3結(jié)晶為原料，配以輔料經(jīng)噴霧、包被、干燥制成的粉狀產(chǎn)品。在樣品的色譜圖中，除25-羥基維生素D3和預(yù)25-羥基維生素D3的色譜峰外，還有其他的色譜峰存在。由于不同生產(chǎn)商所用的原輔料有差異，從7 批次樣品的色譜圖上看，其他峰的種類(lèi)有差異，如圖2 其他峰種類(lèi)較少，圖3 其他峰種類(lèi)較多。

為獲得準(zhǔn)確的測(cè)試結(jié)果，應(yīng)關(guān)注25-羥基維生素D3和預(yù)25-羥基維生素D3與其他色譜峰的分離度情況。從圖2 和圖3 可以看出，按照1.3.2 色譜條件推薦的Agilent Eclipse XDB C18 柱，能得到分離度較好的色譜圖。為考察方法的耐用性，嘗試了其他品牌或者類(lèi)別的C18 色譜柱進(jìn)行分離。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用Waters Symmetry C18 柱也能得到分離度好的色譜圖。而對(duì)于Agilent ZORBAX SB-AQ C18 柱或Waters Atlantic C18柱，在分析樣品時(shí)會(huì)產(chǎn)生分離度差的問(wèn)題。

3 結(jié) 論

圖2 飼料添加劑25-羥基維生素D3 樣品7 色譜圖

圖3 飼料添加劑25-羥基維生素D3 樣品5 色譜圖

本文建立了用高效液相色譜法測(cè)定飼料添加劑25-羥基維生素D3含量的方法，樣品前處理的方法簡(jiǎn)單，有較廣的線(xiàn)性范圍，能滿(mǎn)足市場(chǎng)上不同含量產(chǎn)品的測(cè)定；精密度和加標(biāo)回收率表明該方法能滿(mǎn)足分析要求。本方法具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。