鴨油甘油二酯與殼聚糖聯(lián)合應用對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎修復的影響

王 茜 ，王寶維,*，葛文華，張名愛,，叢紅霞，徐慧心，孔 敏，凡文磊,

（1.青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東青島 266109；2.國家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系營養(yǎng)與飼料功能研究室，山東青島 266109）

炎癥性腸病（IBD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和Crohn 病（CD）[1]。潰瘍性結(jié)腸炎是一種非特異性結(jié)腸炎，其臨床表現(xiàn)包括腹痛、血便等[2]。近年來，人類和動物潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率呈上升趨勢，并伴有向結(jié)腸癌轉(zhuǎn)化的風險[3]，因此尋找安全修復方法具有重要意義。甘油二酯（DG）是油脂酶解的中間產(chǎn)物，在食品、醫(yī)藥等行業(yè)有廣泛的應用[4]，具有抑制革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌[5]、刺激腸道脂質(zhì)代謝[6]等功能。目前，國外對于食品級DG 的研究剛剛起步，少數(shù)產(chǎn)品采用植物油制備。我國肉鴨每年屠宰約45 億只，屠宰產(chǎn)生了大量腹脂、皮脂等副產(chǎn)品，經(jīng)過加工提取和精煉，可獲得到大量鴨油，且價格低廉。本研究室采用鴨油成功制備DG[7]。目前，鴨油甘油二酯（DDG）與其他產(chǎn)品的功能性差異性及其在食品中的應用技術(shù)還缺乏深入研究。Lin 等[8]試驗發(fā)現(xiàn)，富含脂質(zhì)的腸內(nèi)營養(yǎng)可以控制腸缺血再灌注損傷后的腸炎癥，改善腸運動性和黏膜屏障損傷。殼聚糖（CTS）是天然多糖甲殼素脫除部分乙酰基的產(chǎn)物，具有減少脂肪形成[9]、抑制細菌活性[10]等功能。Davydova 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高分子量CTS 可刺激小鼠血清中抗炎癥細胞IL-10 的合成，降低髓過氧化物酶（MPO）活性。目前，國內(nèi)外對殼聚糖抑菌方面的研究已有許多，而DDG 與CTS聯(lián)合使用對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥的修復效果研究未見報道。因此，本文通過探究DDG 與CTS 聯(lián)合應用對小鼠腸道炎癥屏障保護的效果，分析炎癥細胞因子含量的變化，旨在探索腸道健康的新型生物防護方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及飼料配方 6 周齡雄性昆明系小鼠，體重為25～30 g，購自青島大任富城有限公司。DDG 為實驗室自制產(chǎn)品，純度達85%。CTS 購自山東奧康生物科技有限公司（MW：850 000 DA；脫乙酰度：96.1%；批號190416A），按照3%（w/w）的比例將CTS 溶解于1%（v/v）醋酸鹽水中，即CTS 溶液[12]。LD3020 硫酸葡聚糖（MW：50 000）購自合肥博美生物科技有限公司。飼料購于德州諾唯實生物技術(shù)有限公司，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分（風干基礎(chǔ)）

1.2 DDG 的制備方法[13]①將鴨油和水按1:1 放在87℃恒溫水浴鍋中1.5 h，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗除去下層溶液。②在油層中加入一倍的1 mol/L NaOH 溶液，87℃恒溫水解1.5 h。③加入一倍量的NaCl 洗滌除去甘油，調(diào)節(jié)pH 為2～3，釋放游離的脂肪酸。④將混合脂肪酸與甘油按照2.02:1 放入錐形瓶中混合，并加入1.65%固定化南極假絲酵母脂肪酶B，放置在恒溫搖床54℃進行酶解反應。⑤反應結(jié)束后，以2 500 r/min 離心15 min，將酶與底物分離，得到DDG。

1.3 試驗設(shè)計 試驗小鼠飼養(yǎng)于SPF 級動物房，保持室溫24～25℃，人工光照12 h/d，相對濕度40%～60%，試驗開始前適應性喂養(yǎng)1 周，自由飲食。按照《實驗動物福利倫理審查指南》（GB/T 35892-2018）開展本項試驗。

1.3.1 結(jié)腸炎模型建立 參照Chassaing 等[14]的方法建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。設(shè)計對照組與模型組，對照組和模型組組間差異采用獨立性T 檢驗分析，對照組5個重復，模型組20 個重復，每個重復10 只。所有小鼠自由飲食，對照組小鼠自由飲用蒸餾水，模型組將葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶于蒸餾水中配制5%（w/v）的DSS溶液，替代飲用水，每天進行更換，小鼠連續(xù)自由飲用7 d 誘發(fā)結(jié)腸炎，建立潰瘍性結(jié)腸炎模型。對照組與模型組各抽取25 只小鼠，禁食24 h，實施安樂死，收集血樣，檢測致炎因子，測量結(jié)腸長度，驗證模型建立是否成功。

1.3.2 結(jié)腸炎修復試驗 試驗設(shè)計正常對照組、炎癥模型組和炎癥修復組（Ⅰ～Ⅵ組），共8 個組。每組5 個重復，每個重復5 只，共200 只小鼠。炎癥修復組采用2×3 兩因素交叉等重復的析因設(shè)計。正常對照組與炎癥模型組灌服4 mL/kg 生理鹽水，炎癥修復組分別灌服甘油二酯2、3、4 mL/kg 及殼聚糖溶液2、4 mL/kg，所有小鼠均飼喂基礎(chǔ)飼糧。試驗周期為3 周。具體飼喂情況如表2 所示。連續(xù)灌胃7 d 進行修復治療后，對所有小鼠實施安樂死。

表2 試驗期小鼠分組處理情況

1.4 血清生化指標的測定 在試驗結(jié)束時，眼球取血收集血樣，并在3 000 r/min 下離心20 min 獲得血清，并將其儲存在-40℃下。使用ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定血清中白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素4（IL-4）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素17（IL-17）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和干擾素γ（IFN-γ）、MPO 含量。

1.5 結(jié)腸腸道組織學檢測 收集每只小鼠的結(jié)腸，測量結(jié)腸的長度和重量，然后切下結(jié)腸下段相同位置的長0.5 cm的結(jié)腸樣品，在10%中性福爾馬林中固定24 h 后，將結(jié)腸樣品用流水沖洗12 h 后分級酒精溶液脫水，進行石蠟包埋切片，蘇木精和曙紅染色后通過生物顯微鏡觀察不同組之間的組織學變化，并通過數(shù)碼相機獲取圖像，采用LY-WN-HP SUPPER CCD 軟件測量結(jié)腸的絨毛高度和隱窩深度。

1.6 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用 Excel 2016 進行整理，利用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對結(jié)腸炎模型建立階段對照組和模型組組間差異進行獨立性t檢驗分析，結(jié)腸炎修復試驗階段，通過GLM 模型進行2×3 因子分析，差異顯著者用 Duncan's 法進行多重比較。結(jié)果以平均值和集合標準誤（SEM）表示，P＜0.05 表示差異顯著，0.05 ≤P＜0.10表示有趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 DSS 誘導潰瘍性腸炎模型的建立 如表3 可知，飼喂DSS 后，與對照組相比，模型組的體重變化及結(jié)腸長度均顯著降低，模型組TNF-α、IL-6 含量均顯著增加，表明DSS 誘導小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型建立成功[14]。

表3 DSS 對小鼠造模的影響

2.2 DDG 與CTS 聯(lián)合對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重修復、結(jié)腸長度和MPO 活性的影響 如表4 所示，DDG、CTS 對小鼠體重變化影響顯著；DDG 與CTS 交互對于體重變化作用極顯著，Ⅲ組體重變化分別較Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組高1.13%、1.78%、6.48%、5.33%、2.74%（P＜0.01）。DDG、CTS 對于小鼠結(jié)腸長度變化無顯著影響；DDG 與CTS 交互對于結(jié)腸長度作用不顯著。DDG 對MPO 活性影響極顯著；CTS 對MPO 活性變化有顯著影響；DDG 與CTS 交互對MPO 活性影響極顯著，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的MPO 值無顯著差異，但顯著低于其他試驗組。

2.5 DDG 與CTS 聯(lián)合對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠細胞因子水平的影響 修復治療后，各組小鼠的生理指標變化如表5，DDG 對IL-4、IL-17、IL-1β、IFN-γ濃度變化影響極顯著，對于IL-6、TNF-α濃度變化有顯著影響；CTS對IL-4、IL-6、IL-17、IL-1β、IFN-γ、TNF-α濃度變化作用極顯著；Ⅲ組與Ⅴ組的TNF-α濃度無顯著差異，但顯著低于其他試驗組；Ⅲ組的IL-6、IL-17、IL-1β濃度均顯著低于其他各試驗組。DDG 與CTS 交互對IL-4、IL-6、TNF-α濃度的變化有顯著影響，DDG 與CTS 交互對于IL-17、IL-1β、IFN-γ濃度的變化作用極顯著。

綜上所述，經(jīng)過DDG 與CTS 聯(lián)合修復治療可降低結(jié)腸炎小鼠的炎癥反應，減少炎性細胞因子的釋放。

2.6 DDG 與CTS 聯(lián)合對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織發(fā)育的影響 如圖1 可知，正常對照組小鼠結(jié)腸黏膜完整，隱窩腺體完整，無炎性細胞浸潤；與正常對照組相比，炎癥模型組小鼠結(jié)腸黏膜上皮出現(xiàn)較大潰瘍，隱窩結(jié)構(gòu)大部分消失，大量炎性細胞浸潤；與炎癥模型組相比，Ⅰ～Ⅵ組小鼠結(jié)腸黏膜較少缺損，隱窩腺體破壞較輕，炎性細胞較少。

如表6 所知，DDG 對于絨毛高度、線隱比變化作用極顯著，對于隱窩深度無顯著影響；殼聚糖可顯著增加絨毛高度，對隱窩深度與絨隱比無顯著影響；Ⅲ、Ⅳ組絨毛高度顯著高于其他試驗組，Ⅱ組、Ⅲ組的隱窩深度顯著低于Ⅵ組。Ⅲ組的絨隱比高于Ⅴ組、Ⅵ組；DDG 與CTS 交互對絨毛高度、隱窩深度的變化作用顯著，對于絨隱比的變化作用不顯著。

表4 DDG 與CTS 聯(lián)合對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重變量、結(jié)腸長度和MPO 活性的影響

表5 DDG 與CTS 聯(lián)合對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠細胞因子的影響

圖1 各組結(jié)腸組織H&E 染色情況（×20）

表6 DDG 與CTS 聯(lián)合對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸發(fā)育的影響

綜上所述，對于結(jié)腸炎小鼠給予不同水平的DDG與CTS 進行治療，可使結(jié)腸絨毛高度增大，隱窩深度變淺，絨隱比增大，促使小鼠腸道炎癥恢復，其中Ⅲ組修復治療效果最好。

3 討 論

3.1 DDG 與CTS 聯(lián)合對降低炎癥反應的影響 潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥可能是巨噬細胞破壞結(jié)腸黏膜，導致免疫失調(diào)，癥狀為體重減輕、腹瀉、血便、結(jié)腸縮短等[15]，會導致MPO 含量增加，結(jié)腸中MPO 的積累為中性粒細胞進入組織的標志[16]。Park 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，富含中鏈脂肪酸-二酰甘油（MCDG）的食用油與常規(guī)使用的低芥酸菜籽油和橄欖油對照相比，MCDG 可抑制巨噬細胞的吞噬作用。Liu 等[18]通過研究CTS 對DSS 誘導的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群和腸屏障功能的影響發(fā)現(xiàn)，CTS 通過增加體重和結(jié)腸長度等顯示出對結(jié)腸炎的治療效果。DG 對膽汁酸的分泌有抑制作用，可用于預防或治療腹瀉，可治療炎癥[19]。本試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，結(jié)腸炎模型組小鼠體重顯著下降，結(jié)腸長度顯著縮短，這與腸炎造成腸道黏膜損傷、組織壞死、營養(yǎng)物質(zhì)吸收受阻有關(guān)。腸炎造成MPO 含量顯著增加，說明MPO 發(fā)揮了調(diào)控作用，通過催化氧化氯離子產(chǎn)生次氯酸在吞噬細胞內(nèi)殺滅微生物，破壞多種靶物質(zhì)，對調(diào)節(jié)炎癥反應等多方面進行干預。DDG 與CTS 修復治療后，能夠使小鼠體重上升，結(jié)腸長度增加，MPO 含量降低，表明腸道炎癥修復后，腸道組織發(fā)育和營養(yǎng)物質(zhì)吸收恢復正常。DDG 與CTS 聯(lián)合具有降低炎癥反應的協(xié)同作用。

3.2 DDG 與CTS 聯(lián)合對炎癥細胞因子水平的影響 CTS 具有抗菌、抗病毒、抗炎等廣泛的生物活性。Yousef 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，急性結(jié)腸炎小鼠接受CTS 治療后可抑制其結(jié)腸組織中的NF-κB 活化以及TNF-α和IL-6 水平；Yoon 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在增加CTS 濃度的情況下，可降低由革蘭氏陰性細菌的脂多糖（LPS）誘導分泌在RAW 264.7 細胞孵育培養(yǎng)基中的TNF-1 和IL-6，說明CTS 具有抗炎作用。DG 是由丙三醇（甘油）與2 個脂肪酸酯化后得到的產(chǎn)物，是一種天然性油脂，具有抗炎、抑菌等作用。郭夏麗等[22]通過研究樟樹籽油甘油二酯的抑菌活性發(fā)現(xiàn)，樟樹籽油甘油二酯對于革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌均有抑制作用。Wendell 等[23]闡述了脂肪酸可在分解階段釋放大量H 離子，使炎癥細胞代謝衰竭，破壞細胞結(jié)構(gòu)，進而起到抗炎作用。核因子-κB（NF-κB）是調(diào)控炎癥細胞因子基因表達的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，在創(chuàng)傷后的炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用。目前，治療潰瘍性結(jié)腸炎的手段主要有水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類藥物、細胞因子、細胞因子抗體等，共同作用機制是調(diào)節(jié)和阻斷NF-κB/Rel 信號通路，從而減少炎性細胞因子的釋放，或抑制炎性細胞因子的作用，炎性細胞因子中 IL-6、IL-1β、TNF-α等均在轉(zhuǎn)錄水平上為NF-κB/Rel 所控制[24]。本試驗結(jié)果表明，與對照組相比，結(jié)腸腸炎處理組各指標均顯著升高，鴨油甘油二酯與殼聚糖以及交互對各指標均作用顯著，表明鴨油甘油二酯與殼聚糖對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎有一定的修復治療作用，可調(diào)節(jié)免疫紊亂。鴨油甘油二酯與殼聚糖對結(jié)腸炎的改善作用可能是通過抑制NF-κB 通路，減少炎性細胞因子的釋放，其機理有待于繼續(xù)研究。

3.3 DDG 與CTS 聯(lián)合對結(jié)腸組織發(fā)育的影響 絨毛高度、隱窩深度及絨隱比是衡量腸黏膜完整的重要指標[25]。馮俊等[26]在斷奶仔豬的基礎(chǔ)日糧中添加CTS 后發(fā)現(xiàn)，仔豬小腸絨毛高度呈升高趨勢；劉亞楠等[25]研究發(fā)現(xiàn)，不同水平的DDG 與維生素D3可顯著升高結(jié)腸炎大鼠的絨毛高度，降低隱窩深度。陳星等[27]研究發(fā)現(xiàn)，乙酸誘導的結(jié)腸炎仔豬的十二指腸、回腸絨隱比顯著降低。本試驗發(fā)現(xiàn)，炎癥模型組結(jié)腸黏膜缺損，腺體不完整，絨毛高度顯著降低，隱窩深度顯著增加，大量隱窩結(jié)構(gòu)破壞，絨隱比顯著降低，炎性細胞明顯浸潤。經(jīng)過DDG 與CTS 協(xié)同修復治療后，Ⅲ組小鼠修復效果對比于其他各組較好，結(jié)腸黏膜缺損較輕，炎性細胞較少，絨毛高度增加，少量隱窩腺體不完整，隱窩深度降低，絨隱比增加，且大于其他各組，表明DDG 與CTS 聯(lián)合可促進小鼠結(jié)腸組織發(fā)育。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果顯示，DDG 與CTS 聯(lián)合可降低DSS 誘導小鼠結(jié)腸炎炎癥反應，降低腸道炎癥因子水平，可改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠生理指標，促進潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織發(fā)育，具有交互協(xié)同修復治療作用，是一種很有開發(fā)價值的腸道炎癥健康修復劑，其中3 mL/kg DDG與2 mL/kg CTS 組合對于小鼠結(jié)腸炎治療效果最佳。