精氨酸對冷應(yīng)激腹瀉仔豬腸道結(jié)構(gòu)和功能的影響

茍昌勇，施曉麗*，班明政,2，孫澄慧，石 靖，張友平

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，貴州貴陽 551400；3.開陽農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州貴陽 550300）

仔豬腹瀉發(fā)病率在10%～20%，甚至高達(dá)46.5%[1-2]，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了巨大損失。影響仔豬腹瀉的病因復(fù)雜，其中畜舍低溫冷應(yīng)激導(dǎo)致的腹瀉在生產(chǎn)中頻發(fā)[1,3]。腹瀉往往導(dǎo)致仔豬腸道結(jié)構(gòu)損傷和功能紊亂，而腸道功能紊亂是當(dāng)前危害仔豬健康與生長的核心問題[4]。許多研究表明，精氨酸（Arg）及其代謝產(chǎn)物一氧化氮（NO）在許多生理和病理狀態(tài)中起著調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的作用[5-6]，適宜Arg 可促進(jìn)仔豬腸道發(fā)育[5-10]。但較少研究冷應(yīng)激導(dǎo)致的腹瀉狀態(tài)下，Arg 是否可修復(fù)仔豬腸道及其適宜添加水平。本試驗(yàn)擬探討Arg 水平對腹瀉仔豬小腸吸收、腸道結(jié)構(gòu)和發(fā)育的影響，確定仔豬在腹瀉條件下適宜的Arg 水平，以減少仔豬斷奶應(yīng)激，促進(jìn)仔豬生長，為提高養(yǎng)豬生產(chǎn)效益提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料L-精氨酸（醫(yī)藥級，98.5%）、L-丙氨酸（醫(yī)藥級，98.5%）、L-甘氨酸（醫(yī)藥級，98.5%）均購自武漢富馳生物科技有限公司，其他飼料原料購自貴陽新希望飼料有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計及飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計，選擇體重約6.5 kg、在低溫（20℃±3℃）環(huán)境下飼養(yǎng)2～3 d 的28 日齡斷奶仔豬，挑出中等腹瀉（參照Kelly等[11]仔豬腹瀉評分標(biāo)準(zhǔn)，中等腹瀉的糞便稠狀不成形，糞水未分離，糞便評分2 分）大約克仔豬24 頭，于試驗(yàn)第1 天任選3 頭頸靜脈采血后屠宰取腸道樣品，然后將剩下的21 頭分成3 組，參照NRC（1998）5～10 kg 豬營養(yǎng)需要，配制基礎(chǔ)飼糧（表1），各組飼糧Arg 水平分別為1.1%、1.4% 和1.7%，同時添加丙氨酸和甘氨酸（1:1）以保證各組飼糧等氮，添加比例分別為1.0%、0.6%和0.30%。仔豬單欄飼養(yǎng)，舍內(nèi)溫度保持在25～28℃，保溫箱保溫。每天于08:00、12:00、16:00 和20:00 投料，自由采食和飲水。每天觀察記錄仔豬腹瀉和死亡情況。飼養(yǎng)試驗(yàn)全期14 d。

1.3 樣品采集

1.3.1 血液樣品采集及處理 試驗(yàn)開始第1 天選取3 頭、第14 天每組分別任選3 頭，分別在第1 天和第14 天按1 mL/kg 體重灌服10%（體重/體積）D-木糖1 h 后，前腔靜脈采血5 mL，置于加有肝素鈉的真空管中，靜置15 min，然后3 000 r/min、4℃離心20 min 取血漿3份，存于-80℃?zhèn)溆么郎y。

1.3.2 腸道樣品采集及處理 采血后，戊巴比妥鈉麻醉后，迅速剖開腹腔取小腸，排盡食糜。十二指腸距胃幽門5 cm 處取樣，從空腸中段和回腸中段截取10 cm，用預(yù)冷生理鹽水冼凈腸段，剪取2 cm 置于10%中性甲醛中固定，用于組織形態(tài)學(xué)觀察。剩余腸段用濾紙吸干水分，用剪刀的鈍面刮取腸黏膜，分裝到5 mL 凍存管中，立即放入液氮中速凍，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存待測。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 十二指腸、空腸和回腸組織形態(tài)學(xué)觀察 腸道固定樣品經(jīng)脫水、包埋、切片、伊紅-蘇木精染色等處理后，用Olympus C011 顯微鏡觀測其形態(tài)結(jié)構(gòu)，掃描切片，用CaseViewer 3.2 軟件測量絨毛高度和隱窩深度，每個樣本觀察3 個非連續(xù)切片，每張切片選取3 個視野，每個視野測定10 個絨毛長度和隱窩深度，其平均值作為1 個測定數(shù)據(jù)。

1.4.2 腸道發(fā)育指標(biāo) 腸道黏膜蛋白質(zhì)含量采用Bradford的考馬斯亮蘭法測定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。腸道黏膜DNA 濃度用紫外可見分光光度法測定，RNA 濃度通過測定232 nm 和260 nm 處的吸光度值，用F1eck-Begg 公式算出。DNA、RNA 和蛋白質(zhì)濃度分別乘以黏膜重量即得DNA、RNA 和蛋白質(zhì)在腸黏膜中的總量。血漿D-木糖含量采用間苯三酚比色法測定。腸黏膜NO 含量采用硝酸還原酶比色法測定；腸黏膜一氧化氮合成酶（NOS）含量采用NOS 催化Arg 比色法測定。上述試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及其營養(yǎng)成分

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用One-Way ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析和Duncan's多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Arg 水平對腹瀉仔豬腸道形態(tài)的影響 由表2 可見，1.4%Arg 組仔豬十二指腸絨毛高度分別比1.1%Arg 組、1.70%Arg 組和試驗(yàn)起始組提高70.99%、65.69% 和90.35%（P＜0.01），但1.1%Arg 組、1.7%Arg 組和試驗(yàn)起始組間無顯著差異；添加Arg 亦可提高腹瀉仔豬空腸和回腸絨毛高度（P＜0.05），雖然Arg 水平間無顯著差異，但仔豬在攝入1.4%Arg 組飼糧時其回腸（P=0.068）和空腸絨毛長度均有提高趨勢（P=0.073）；而Arg 水平對十二指腸、空腸和回腸隱窩深度均無顯著影響；隨著Arg 水平提高，十二指腸和空腸的絨毛高度/隱窩深度隨之提高，以1.4%Arg 組水平為最高；Arg 水平對回腸的絨隱比影響也呈相同趨勢，以1.70%Arg 組為最高，但1.4%Arg 組和1.70%Arg 組間無顯著差異。表明飼糧中添加適宜Arg 促進(jìn)腹瀉仔豬腸道功能的恢復(fù)。

2.2 Arg 水平對腹瀉仔豬腸道發(fā)育的影響 由表3 可見，采食1.1%Arg 組和1.4%Arg 組飼糧仔豬血漿木糖含量高于1.7%Arg 組和腹瀉起始組（P＜0.01），表明適宜Arg 水平促進(jìn)仔豬腸道的吸收，過高不利于改善冷應(yīng)激下仔豬腸道健康。十二指腸、空腸和回腸蛋白、DNA和RNA 含量均隨著Arg 水平提高而提高，Arg 水平為1.4%時達(dá)到最大值，增加至1.7%水平卻顯著或極顯著降低。而仔豬十二指腸、空腸和回腸中NO、總一氮化氮合成酶（TNOS）及誘導(dǎo)型一氮化氮合成酶（iNOS）均隨著Arg 水平提高而提高（P＜0.01）。

3 討 論

3.1 Arg 對腸道吸收和腸道結(jié)構(gòu)的影響 仔豬腹瀉導(dǎo)致仔豬消化道組織學(xué)和形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷性變化[4,12-13]、腸道結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化，直接影響著仔豬腸道的消化和吸收功能[14]。當(dāng)腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)受損，D-木糖吸收降低，血漿D-木糖含量亦隨之降低，木糖吸收試驗(yàn)是研究小腸吸收功能的重要評價方法[4]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨Arg 水平提高，仔豬血漿D-木糖含量顯著上升，以1.4%Arg 水平的D-木糖含量最高，但Arg 水平升至1.7%時，D-木糖含量顯著降至腹瀉起始水平，表明1.4%Arg 可改善腸道黏膜吸收功能，過高則不利于腸道吸收。小腸形態(tài)指標(biāo)變化支持這一點(diǎn)，絨毛高度和絨隱比與血漿D-木糖含量間平行，絨毛越高，絨隱比越大，血漿D-木糖含量越高。給缺血和內(nèi)毒素作用損害腸道功能的大鼠飼喂Arg 水平飼糧，同樣可減輕腸道黏膜損傷，改善腸道黏膜吸收功能[15-16]。采食1.52% Arg 飼糧的14 日齡斷奶仔豬小腸腸絨毛高度明顯提升，十二指腸和空腸隱窩深度降低，當(dāng)Arg 增加至2.02% 時，小腸各段絨毛高度降至0.8%Arg 水平[17]。黃晶晶[8]用脂多糖攻擊仔豬的試驗(yàn)顯示，1.76%～2.26% Arg 可緩解應(yīng)激仔豬腸道細(xì)胞的凋亡，刺激腸細(xì)胞的增殖，表明適宜Arg 可促進(jìn)腸道上皮生長分化，維持腸黏膜的完整和吸收功能[15]。研究發(fā)現(xiàn)，7 日齡斷奶仔豬適宜Arg 為1.41%～1.61%[18]，而21～28 和28～35 日齡的適宜Arg則分別1.17% 和0.97%[9,16]，表明仔豬年齡越小，Arg需要量越高。田一航等[10]報道低體重仔豬的Arg 需要量高于正常體重仔豬。本試驗(yàn)冷應(yīng)激中等腹瀉仔豬的適宜Arg 為1.4%。曲紅炎[3]試驗(yàn)雖未給出基礎(chǔ)飼糧Arg營養(yǎng)水平，但結(jié)果表明添加0.8%～1.2% Arg 可提高冷應(yīng)激仔豬增重和免疫力。上述研究表明，仔豬日齡、體重和脂多糖應(yīng)激影響維持仔豬腸道生長或緩解腸道損傷的Arg 需要，但現(xiàn)有研究較少關(guān)注生產(chǎn)中冷應(yīng)激腹瀉及其程度與Arg 的供求關(guān)系。本試驗(yàn)只顯示，中等腹瀉28～42 d 仔豬飼喂1.4%Arg 飼糧可修復(fù)腹瀉仔豬小腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)和維持吸收功能。而輕度或重度腹瀉仔豬Arg需要在不同體重日齡是否有變化，則有待于進(jìn)一步研究。因挑選腹瀉程度、體重和年齡均相近的仔豬較為困難，試驗(yàn)設(shè)計不盡合理，試驗(yàn)動物較少，有必要增大樣本容量，以進(jìn)一步驗(yàn)證Arg 對腹瀉仔豬腸道的調(diào)節(jié)作用。

表2 Arg 水平對腹瀉仔豬小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

表3 Arg 水平對腹瀉仔豬小腸吸收和黏膜發(fā)育的影響

3.2 Arg 對腸道功能的調(diào)節(jié) 腸道黏膜DNA、RNA 和蛋白質(zhì)是小腸細(xì)胞生長和修復(fù)的基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)和DNA含量增加意味著小腸細(xì)胞合成代謝加快[8,15-17]。研究發(fā)現(xiàn)，Arg 缺乏，動物機(jī)體DNA、RNA 和蛋白質(zhì)合成速率會大幅度降低[19]，添加Arg 顯著提高回腸黏膜DNA和蛋白質(zhì)含量[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，提高Arg 水平極顯著刺激仔豬各腸段黏膜DNA、RNA 和蛋白合成，仔豬腸道絨毛高度與黏膜DNA、RNA 及蛋白含量間有極好的平行性，說明Arg 是通過促進(jìn)腸道黏膜生長來緩解腹瀉對仔豬腸道的損傷。黃晶晶[8]試驗(yàn)亦證實(shí)添加Arg可增加脂多糖攻擊仔豬小腸黏膜蛋白質(zhì)和DNA 含量，減輕腸道應(yīng)激。許多研究探討了Arg 參與腸道功能調(diào)節(jié)的途徑，認(rèn)為Arg 可能是通過其代謝產(chǎn)物多胺或鳥氨酸參與DNA 合成，增加腸黏膜蛋白質(zhì)[20-22]。Arg 也可通過提高NO 含量清除部分氧自由基，減輕腸黏膜脂質(zhì)過氧化損害，緩解黏膜蛋白質(zhì)合成的減少，促進(jìn)小腸康復(fù)[18,23]。NO 在NOS 催化下由Arg 氧化分解產(chǎn)生[5-6]。神經(jīng)型NOS（nNOS）和內(nèi)皮型NOS（eNOS）常規(guī)表達(dá)，間歇催化生成低水平NO，以維持細(xì)胞正常功能；細(xì)胞因子和內(nèi)毒素激活誘導(dǎo)型NOS（iNOS），iNOS 可加強(qiáng)或消除各種炎癥反應(yīng)，在許多疾病條件下iNOS 可加劇機(jī)體組織的受損程度[5-6]。許多研究亦表明，提高Arg可增加iNOS 活性，促進(jìn)NO 生成，適宜NO 產(chǎn)量促進(jìn)腸道發(fā)育恢復(fù)，過高則加劇腸道損傷[6-7,12,23]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，NO 含量不僅與TNOS 和iNOS 活性相關(guān)，也與Arg 水平正相關(guān)，但腸絨毛高度、蛋白質(zhì)、DNA 和RNA 含量則在1.4%Arg 水平達(dá)到最高后又下降，表明過高Arg 有損腸道修復(fù)，抑制仔豬生長[24]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，適宜Arg 水平有利于腹瀉仔豬修復(fù)腸道結(jié)構(gòu)和功能，過高Arg 加劇腸道損傷，冷應(yīng)激中等腹瀉仔豬適宜Arg 水平為1.4%；Arg 可能通過提高NOS 活性，產(chǎn)生適量NO，促進(jìn)腸道DNA、RNA 和蛋白質(zhì)合成，修復(fù)腸道結(jié)構(gòu)和功能。然而本研究中試驗(yàn)動物較少，需增大樣本容量，進(jìn)一步驗(yàn)證Arg 對腸道調(diào)節(jié)作用和適宜水平，以利于在實(shí)際生產(chǎn)中科學(xué)合理應(yīng)用。