基于MeDIP-seq 研究蛋氨酸對巨噬細(xì)胞炎癥中甲基化水平的影響

徐翌斌，羅成龍，瞿 浩，計(jì) 堅(jiān)，舒鼎銘

（畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，廣東廣州 510640）

蛋氨酸（Methionine，Met）作為家禽玉米-豆粕型日糧的第一限制性氨基酸，也是動(dòng)物體內(nèi)的必需氨基酸，對提高家禽的免疫功能、生長性能和抗氧化性等方面至關(guān)重要[1]。當(dāng)日糧缺乏Met 時(shí)，肉雞會(huì)出現(xiàn)食欲減退、生長緩慢和免疫功能缺陷等癥狀[2]。Li 等[3]研究表明，Met 不僅能參與免疫分子（細(xì)胞因子、抗體、補(bǔ)體等）的合成，同時(shí)介導(dǎo)了免疫組織和器官的正常發(fā)育。同時(shí)，Met 可通過提高機(jī)體內(nèi)血清溶菌酶活性、外周淋巴細(xì)胞活性和和白細(xì)胞的吞噬活性[4]，積極參與調(diào)節(jié)機(jī)體的固有免疫和體液免疫[5-6]。

Met 是機(jī)體內(nèi)重要的甲基供體之一，參與眾多的DNA 甲基化過程[7]。DNA 甲基化在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因的表達(dá)，高甲基化狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)抑制，而低甲基化狀態(tài)會(huì)促進(jìn)基因表達(dá)。Wichnieski 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基化與動(dòng)物機(jī)體炎癥和衰老等眾多生理疾病密切相關(guān)。用甲基化方式調(diào)控炎癥因子或炎癥信號通路的表達(dá)可以緩解炎癥反應(yīng)[9]。Arroyo-Jousse 等[10]研究表明半胱氨酸可提高TNF-α啟動(dòng)子區(qū)高甲基化水平從而緩解炎癥反應(yīng)。本課題組前期發(fā)現(xiàn)Met 能緩解脂多糖（LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[11]，但其分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此，本研究從甲基化角度初步探究DNA甲基化與Met 抑制LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥中調(diào)控機(jī)制的相關(guān)性，進(jìn)而為Met 調(diào)控免疫功能提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試驗(yàn)相關(guān)試劑 本試驗(yàn)的小鼠巨噬細(xì)胞所用RAW264.7 細(xì)胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC細(xì)胞庫）。Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素/ 鏈霉素抗生素購自Gibco 公司。蛋氨酸、脂多糖、二甲基亞砜購自Sigma公司。磷酸緩沖溶液購自上海生工生物公司。

1.2 巨噬細(xì)胞處理 將細(xì)胞鋪板至6 孔板中，接種密度為1×106個(gè)/mL，細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。設(shè)置空白（Ctr）組、LPS 組和Met+LPS 組，每組3 個(gè)重復(fù)。Ctr 組細(xì)胞為正常培養(yǎng)基細(xì)胞（不添加LPS 和Met），LPS 組細(xì)胞為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)后添加100 ng/mL 的LPS刺激3 h，Met+LPS 組細(xì)胞為含10 mmol/L 的Met 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h 后，用100 ng/mL 的LPS 刺激3 h。

1.3 全基因組甲基化測序 收集各組處理后的巨噬細(xì)胞（共3 組，每組3 個(gè)重復(fù)）放置干冰，委托安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司完成MeDIP-seq。操作步驟：提取并純化巨噬細(xì)胞全基因組 DNA；將基因組 DNA 打斷至100～500 bp；對全基因組 DNA 片段末端進(jìn)行修復(fù)，在3'端加腺嘌呤，并連接測序接頭，雙鏈 DNA 單鏈化；采用 5-甲基胞嘧啶抗體對測序接頭DNA 進(jìn)行沉淀富集；Q-PCR 擴(kuò)增后跑膠，切膠純化并質(zhì)控產(chǎn)物；合格文庫用于上機(jī)測序。

1.4 全基因組甲基化測序的生物信息學(xué)分析 對下機(jī)數(shù)據(jù)序列進(jìn)行去污染和去低質(zhì)量處理，將篩選后的reads 與參考基因組（mm10）進(jìn)行定位對比并統(tǒng)計(jì)信息，每條read最多允許3 個(gè)堿基錯(cuò)配。基于MACS 軟件對全基因組處理后的序列進(jìn)行甲基化峰（peak）掃描，得到每組樣品的peak 區(qū)域信息結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)在基因元件（upstream2k、5'UTR、CDS、Intron、3'UTR、downstream2k）上的分布，并進(jìn)行對比分析。根據(jù)差異的read 數(shù)量，將差異的基因分為高甲基化基因和低甲基化基因。例如，樣品1 vs.樣品2，同一個(gè)peak 區(qū)域內(nèi)樣品2 的reads 數(shù)量高于樣品1 的基因?yàn)楦呒谆颍粗疄榈图谆颍êY選條件：P＜0.01，兩樣本在相同基因元件內(nèi)都有覆蓋，且覆蓋度的差異在2 倍以上），并統(tǒng)計(jì)在基因組不同區(qū)域上差異甲基化基因的分布。最后，將兩樣品間的差異基因進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 功能分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組測序數(shù)據(jù)處理 如表1 所示，在Ctr 組、LPS組 和LPS+Met 組分別得到177 730 085、176 089 330、163 741 744 個(gè)比對reads 數(shù)和151 460 128、151 069 422、140 320 769 個(gè)唯一比對reads 數(shù)，比對率達(dá)分別達(dá)53.04 %、56.38 %和54.04 %，唯一比對率分別達(dá)45.2 %、48.37 %和46.31 %，并且LPS 組的比對率和唯一比對率均高于Ctr 組，而LPS+Met 組的比對率和唯一比對率均低于LPS 組。

表1 MeDIP-seq 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 統(tǒng)計(jì)MeDIP-Seq 的甲基化峰（Peak）信息 基于MACS 軟件對各組細(xì)胞的MeDIP-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行peak 掃描并統(tǒng)計(jì)信息。如表2 所示，LPS 組的peak 數(shù)量、總長度和覆蓋率均高于Ctr 組，而LPS+Met 組的peak 數(shù)量、總長度和覆蓋比例均低于LPS 組。

表2 Ctr 組、LPS 組和LPS+Met 組中peak 區(qū)域信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 統(tǒng)計(jì)富集區(qū)域在基因不同區(qū)域上的分布 運(yùn)用MACS 軟件定位peak 的位置相關(guān)信息，對peak 位置進(jìn)行基因功能分類（upstream2k：轉(zhuǎn)錄上游2 000 bp 區(qū)；5'UTR：5' 端非翻譯區(qū)；CDS：編碼序列區(qū)；Intron：內(nèi)含子區(qū)；3'UTR：3'端非翻譯區(qū)；downstream2k：轉(zhuǎn)錄下游2 000 bp 區(qū)）。如圖1 所示，多數(shù)的peak 分布在Intron 區(qū)（約51%）。

2.4 統(tǒng)計(jì)兩組間差異甲基化基因數(shù) 根據(jù)差異的reads數(shù)量，將差異的基因分為高甲基化基因和低甲基化基因，并定位到基因元件上。如圖2 可見，在Ctr 組和LPS 組不同基因元件上共鑒定出217 個(gè)低甲基化基因和506 個(gè)高甲基化基因，其中在LPS 組每個(gè)不同基因功能元件上高甲基化基因數(shù)都多于低甲基化基因數(shù)。而在LPS組和LPS+Met 組共鑒定出459 個(gè)低甲基化基因和122個(gè)高甲基化基因，其中在LPS+Met 組每個(gè)不同基因功能元件上高甲基化基因數(shù)都低于低甲基化基因數(shù)。

2.5 差異甲基化基因的GO 富集分析 基于本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Met 能夠緩解LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)[11]。以下研究重點(diǎn)分析LPS 組和LPS+Met 組中巨噬細(xì)胞差異甲基化基因。如圖3 所示，GO 富集分析包括生物學(xué)進(jìn)程、分子功能和細(xì)胞成分3 大類。生物學(xué)進(jìn)程中主要富集在單一生物過程（Single-Organism Process）和細(xì)胞過程（Cellular Process），細(xì)胞成分主要富集在細(xì)胞（Cell）和細(xì)胞部分（Cell Part），分子功能主要富集在結(jié)合（Binding）上。生物進(jìn)程上共富集有419 個(gè)高甲基化基因和1 576 個(gè)低甲基化基因，有517 個(gè)高甲基化基因和397 個(gè)低甲基化基因富集在分子功能，有1 277 個(gè)高甲基化基因和3 129 個(gè)低甲基化基因富集細(xì)胞組成。在3 大類GO 富集功能上總的低甲基化基因數(shù)（3 129 個(gè)）明顯多于總高甲基化基因（862 個(gè)）。

圖1 Ctr 組、LPS 組和LPS+Met 組中peak在不同基因功能元件上的分布Ctr vs LPS

圖2 基于不同基因元件上Ctr 組、LPS 組和LPS+Met 組間差異甲基化基因的分布

2.6 差異甲基化基因的KEGG 功能分析 KEGG Pathway是分析peak 區(qū)域相關(guān)基因所涉及到的細(xì)胞信號通路，選擇基因富集最顯著的20 個(gè)通路來進(jìn)行分析。如圖4 所示，Q 值越小，甲基化基因富集越顯著，其中最富集的通路是Hippo 信號通路（Hippo Signaling Pathway），隨后是細(xì)胞粘附分子（Cell Adhesion Molecules）、谷氨酸能突觸（Glutamatergic Synapse）、軸突傳導(dǎo)（Axon Guidance）、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控（Regulation of Actin Cytoskeleton）、磷酸肌醇代謝（Inositol Phosphate Metabolism）等通路。

3 討 論

Met 作為家禽第一限制性氨基酸，又是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)重要的甲基供體之一，在DNA 轉(zhuǎn)移酶（Dnmts）的作用下參與DNA 甲基化，在調(diào)控動(dòng)物機(jī)體免疫功能等方面發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Met 能緩解LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[11]，但其分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。首先，本研究利用MeDIP-seq 技術(shù)分析Met 影響巨噬細(xì)胞炎癥中全基因組DNA 甲基化變化特征，其次，確定差異甲基化基因與生物學(xué)功能之間的關(guān)系，并初步探究Met 抑炎的分子機(jī)制。本研究結(jié)果表明，Met 能緩解LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的高甲基化水平，差異甲基化基因主要富集在Hippo 信號通路。

圖3 LPS 組與 LPS+Met 組的差異甲基化基因GO 富集結(jié)果

圖4 LPS 組與 LPS+Met 組的差異甲基化基因KEGG 富集散點(diǎn)圖

MeDIP-seq 是基于抗體富集原理進(jìn)行全基因組甲基化測序的一種高通量測序技術(shù)，可以統(tǒng)計(jì)整個(gè)基因組DNA 甲基化譜的分布，并能夠高效率地檢測出全基因組中甲基化差異的區(qū)域，是目前比較不同細(xì)胞、組織或疾病個(gè)體樣本間的全基因組DNA 甲基化差異的檢測技術(shù)[12]。本研究測序結(jié)果表明，Ctr 組、LPS 組和LPS+Met 組分別 產(chǎn)生了177 730 085、176 089 330、163 741 744 個(gè)唯一比對read 數(shù)，在此基礎(chǔ)上利用MACS軟件進(jìn)一步分別鑒定出160 467、169 253、163 576 個(gè)甲基化峰（peak）區(qū)域，大多數(shù)的peak 定位在基因Intron 區(qū)，分析發(fā)現(xiàn)LPS 組中鑒定出的peak 數(shù)量和覆蓋比例均大于Ctr 組，而Met+LPS 組的peak 數(shù)量和覆蓋比例均小于LPS 組。結(jié)果表明LPS 組的甲基化程度高于Ctr 組，Met+LPS 組的甲基化程度低于LPS 組，添加Met 后能夠緩解LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥高甲基化水平。

根據(jù)peak 內(nèi)read 數(shù)量在不同基因功能元件上挖掘分析各組間的差異甲基化基因。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于Ctr 組，LPS 組每個(gè)不同基因功能元件上的高甲基化基因數(shù)均多于低甲基化基因數(shù)，而相較于LPS 組，LPS+Met 組每個(gè)不同基因功能元件上的高甲基化基因數(shù)均低于低甲基化基因數(shù)。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)甲基供體Met 的補(bǔ)充能夠緩解LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中基因組高甲基化水平，這與前期研究結(jié)果一致。Osorio 等[13]發(fā)現(xiàn)飼喂添加Met 飼料的荷斯坦奶牛中全基因組DNA甲基化水平程度較低。Yang 等[14]發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加Met 的小鼠中FABP4啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平有所降低。另外一項(xiàng)相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，給母體或斷奶后小鼠補(bǔ)充葉酸（甲基供體）飼養(yǎng)，其全基因組DNA 甲基化程度降低[15]。導(dǎo)致這一類現(xiàn)象的原因或許與DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)有關(guān)。動(dòng)物機(jī)體內(nèi)Dnmts 分為Dnmt1、Dnmt2 和Dnmt3 3 類，其 中Dnmt3 包 括3 個(gè)亞類：Dnmt3a、Dnmt3b 和Dnmt3l。Dnmt1 是維持甲基化轉(zhuǎn)移酶，Dnmt2 的甲基轉(zhuǎn)移酶活性尚不明確，Dnmt3a 和Dnmt3b 是從頭合成甲基化轉(zhuǎn)移酶，Dnmt3l 缺乏甲基化酶活性，但可以與Dnmt3a 和Dnmt3b 相互作用[16-18]。Li 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充葉酸能通過下調(diào)Dnmt1和Dnmt3a的表達(dá)而誘導(dǎo)高脂飼糧小鼠中肥胖相關(guān)基因低甲基化。另外，Kohno 等[20]研究發(fā)現(xiàn)Dnmt3a在動(dòng)物體內(nèi)調(diào)控能量代謝穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重大作用。Dnmt1和Dnmt3b基因可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中炎癥基因的表達(dá)[21-23]。探索各類甲基轉(zhuǎn)移酶在Met 介導(dǎo)DNA 甲基化調(diào)控炎癥反應(yīng)的影響值得進(jìn)一步深入研究。

本研究通過GO 富集和KEGG 對LPS 組與Met+LPS組之間的差異甲基化基因進(jìn)行分析。GO 富集分析發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)過程（Biological Process）中差異甲基化基因主要富集在單一生物過程（Single-Organism Process）和細(xì)胞過程（Cellular Process）。GO 富集的每個(gè)生物學(xué)分類上的高甲基化基因數(shù)均少于低甲基化基因數(shù)，進(jìn)一步證實(shí)Met 能夠降低LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中基因組高甲基化水平。通過KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，甲基化基因主要富集在Hippo 信號通路上。Hippo 信號通路最早發(fā)現(xiàn)于果蠅研究中，主要是調(diào)控細(xì)胞的生長，組織器官的大小以及抑制癌癥等[24]。同時(shí)，Zhou 等[25]研究表明Hippo 信號通路在調(diào)節(jié)免疫功能和維持免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重大作用。在抑制果蠅的Hippo 信號通路情況下，果蠅會(huì)更容易被革蘭氏陽性菌感染，致死率提高[26]。Wang 等[27]研究表明不同的血流模式可通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的Hippo 信號通路來抑制炎癥并緩解動(dòng)脈粥樣硬化的形成。IL-4/IL-13 誘導(dǎo)M2 巨噬細(xì)胞極化和LPS/IFN-γ誘導(dǎo)的M1 巨噬細(xì)胞極化可以通過Hippo 信號來調(diào)節(jié)[28]。抑制Hippo 信號通路，能增強(qiáng)LPS/TLR4 介導(dǎo)NF-κB 信號通路的活化，增加促炎因子IL-6 和TNF-α的表達(dá)[29]。Hippo 通路還參與腫瘤免疫反應(yīng)，其關(guān)鍵蛋白Yap 活化有助于腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)的清除[30]。

4 結(jié) 論

本研究運(yùn)用MeDIP-seq 技術(shù)發(fā)現(xiàn)，Met 能緩解LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞DNA 高甲基化水平，差異甲基化基因主要富集在Hippo 信號通路。通過本研究分析有助于初步理解Met 抑炎的分子調(diào)控機(jī)制，在畜禽生產(chǎn)中為Met 調(diào)控機(jī)體免疫功能提供一定的理論基礎(chǔ)。