薩福克羊血清中蛋白含量與超排效果相關(guān)性研究

趙冰茹 ，陳 童，董 紅，毋狀元，羅永明，阿依努爾·亞森，季 斐,4，鄭新寶*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，新疆烏魯木齊 830011；3.新疆阿勒泰地區(qū)畜牧獸醫(yī)站，新疆阿勒泰 836501；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的變化，羊肉因其肉質(zhì)鮮美、豐富的營養(yǎng)價(jià)值以及獨(dú)特的保健作用而受到越來越多人的喜愛[1-2]。為提高肉羊的繁殖效率、提供更多的肉用綿羊，胚胎移植技術(shù)廣泛運(yùn)用于肉用綿羊育種中，而超數(shù)排卵技術(shù)作為胚胎移植中的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，是充分挖掘良種母羊的遺傳潛力和為肉羊產(chǎn)業(yè)提供大量優(yōu)質(zhì)胚胎的重要手段[3-5]。

超數(shù)排卵通過注射外源性激素來提高血液中促性腺激素濃度，減少閉鎖卵泡數(shù)量，從而使卵泡發(fā)育并排卵，能夠?yàn)榕咛ヒ浦蔡峁┐罅績?yōu)質(zhì)胚胎[6]。影響超數(shù)排卵效果的因素包括個(gè)體生理狀態(tài)、遺傳特性等內(nèi)在因素，以及不同的外源性激素和超數(shù)排卵方法、不同季節(jié)等外在環(huán)境因素[7]。生物體自身的生理、健康狀態(tài)對(duì)于排卵率也存在影響。病原體的侵入使機(jī)體快速發(fā)生高強(qiáng)度的特異性免疫應(yīng)答，從而使機(jī)體的穩(wěn)定狀態(tài)發(fā)生偏移，為了抵抗病原體的入侵，機(jī)體免疫球蛋白的數(shù)量會(huì)相應(yīng)增加[8]。而關(guān)于血清中蛋白含量等指標(biāo)對(duì)超數(shù)排卵效果的影響尚未見報(bào)道，本研究旨在探討供體綿羊血清中蛋白含量和超數(shù)排卵效果的相關(guān)性，為改善綿羊超數(shù)排卵效果提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均來自新疆天山畜牧生物工程股份有限公司種羊場(chǎng)，分2 批隨機(jī)選擇2～4 歲，健康、無繁殖疾病的45 只和60 只薩福克羊作為供體母羊。

1.2 藥品和試劑 本實(shí)驗(yàn)用于同期發(fā)情和超數(shù)排卵的主要藥品和試劑包括注射用氯前列烯醇鈉（PG）、垂體促卵泡素（FSH）、促黃體素釋放激素A3（LHRH），均購自寧波市三生藥業(yè)有限公司。采卵液為自配，胚胎保存液（Holding）為美國AB 公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物超排前1 個(gè)月根據(jù)供體母羊膘情進(jìn)行補(bǔ)飼，每只母羊每天精料添至800 g、胡蘿卜200 g、苜蓿草2 kg，青貯玉米2 kg。配備舔磚，精料中添加亞硒酸鈉等微量元素。進(jìn)行必要的防檢疫和驅(qū)蟲工作，觀察供體母羊體況及繁殖周期，確定體況良好、無疾病和不良癥狀后，開始同期發(fā)情和超數(shù)排卵處理。超排前1 天采集外周血，經(jīng)3 000 r/min 離心10 min 后分離出血清。使用FSH 減量法對(duì)供體母羊進(jìn)行超排，在發(fā)情周期的第9～12 天以遞減計(jì)量每天早晚各注射1次FSH，總劑量為10 mg/ 只；在超數(shù)排卵第3 天時(shí)注射1 支PG，在母羊發(fā)情后14 h 進(jìn)行腹腔鏡輸精，并注射LHRH；在供體母羊發(fā)情配種的第6～7 天進(jìn)行手術(shù)法沖胚，同時(shí)統(tǒng)計(jì)黃體數(shù)、回收總卵數(shù)、可用胚胎數(shù)等。在實(shí)驗(yàn)室測(cè)定血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白含量，分析與超排結(jié)果的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，按回收總卵數(shù)分為低回收總卵數(shù)組≤5 個(gè)、中回收總卵數(shù)組5～10 個(gè)、高回收總卵數(shù)組≥10 個(gè)。使用SPSS 24.0 軟件對(duì)不同比較組數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，單因素方差分析及Duncan's多重比較，并利用Curve Estimation 方法建立回收總卵數(shù)與血清生理指標(biāo)間的最優(yōu)回歸模型。

2 結(jié)果

2.1 不同回收總卵數(shù)供體羊超排效果 由表1 可知，高回收總卵數(shù)組的回收總卵數(shù)、可用胚胎數(shù)、黃體數(shù)極顯著高于其余2 組，中回收總卵數(shù)組的回收總卵數(shù)、可用胚胎數(shù)極顯著高于低回收總卵數(shù)組，中回收總卵數(shù)組和低回收總卵數(shù)組的黃體數(shù)無顯著差異。

2.2 不同組間供體羊血清蛋白濃度 由表2 可知，低回收總卵數(shù)組的總蛋白、球蛋白濃度極顯著高于其余2 組，低回收總卵數(shù)組和中回收總卵數(shù)組的白蛋白濃度極顯著高于高回收總卵數(shù)組；高回收總卵數(shù)組和中回收總卵數(shù)組間的總蛋白、球蛋白濃度差異不顯著，低回收總卵數(shù)組和中回收總卵數(shù)組的白蛋白濃度差異不顯著。

2.3 建立最優(yōu)回歸模型 利用血清中蛋白含量對(duì)回收總卵數(shù)進(jìn)行逐步回歸分析，總蛋白在回歸模型中對(duì)回收總卵數(shù)影響極顯著（P＜0.01），而白蛋白、球蛋白、白球比對(duì)回收總卵數(shù)影響不顯著（P＞0.05），已從回歸模型中剔除。根據(jù)回歸分析原理，回歸模型R2越接近1 時(shí)，該回歸模型越接近實(shí)測(cè)值，如表3 所示，血清中蛋白含量對(duì)回收總卵數(shù)的最優(yōu)回歸模型為y=137.571－2.971x+0.016x2（R2=0.690，P＜0.01）。

3 討 論

超數(shù)排卵是胚胎移植過程的關(guān)鍵技術(shù)，而超數(shù)排卵后的胚胎收集對(duì)于快速繁殖優(yōu)良種畜也十分重要[9]。本研究利用FSH 對(duì)薩福克供體母羊進(jìn)行超數(shù)排卵處理，獲得平均可用胚胎數(shù)為4.83 個(gè)，低于黑頭薩福克羊超數(shù)排卵獲得平均可用胚胎數(shù)（6.08 個(gè)）[10]、利用褪黑素處理供體母羊獲得平均可用胚胎數(shù)7.40 個(gè)[11]，這可能與褪黑激素能夠顯著提高胚泡率[12]有關(guān)。本研究分析表明，總蛋白、白蛋白濃度與回收總卵數(shù)、可用胚胎數(shù)均存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，球蛋白濃度與回收總卵數(shù)存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，即隨著總蛋白、球蛋白、白蛋白濃度的升高，回收總卵數(shù)和可用胚胎數(shù)均呈下降趨勢(shì)；分組分析發(fā)現(xiàn)高回收總卵數(shù)組的總蛋白、白蛋白、球蛋白濃度極顯著低于低回收總卵數(shù)組，即高回收總卵數(shù)組具有較低的蛋白濃度，與相關(guān)性分析結(jié)果一致。

表2 不同回收總卵數(shù)供體羊血清蛋白濃度 g/L

表3 最優(yōu)回歸分析結(jié)果

對(duì)于哺乳動(dòng)物來講，在飼養(yǎng)過程中都可能會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激，而應(yīng)激對(duì)于雌性動(dòng)物繁殖生理和行為存在著負(fù)面影響，主要為干擾排卵、干擾植入卵母細(xì)胞的成熟、抑制接受交配的行為。在應(yīng)激反應(yīng)中，下丘腦釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH），導(dǎo)致垂體促腎上腺皮質(zhì)釋放激素（ACTH）釋放，ACTH 的目標(biāo)器官是腎上腺皮質(zhì)，其中ACTH 調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇釋放，從而對(duì)各個(gè)器官產(chǎn)生一些下游的負(fù)面生理影響[13]。應(yīng)激期間生殖性能受到抑制是由于皮質(zhì)醇在下丘腦-垂體軸上的負(fù)反饋導(dǎo)致黃體生成激素脈沖頻率降低，進(jìn)而導(dǎo)致會(huì)抑制卵泡的生長，排卵率和受精[14]。Macedo 等[15]觀察到受到應(yīng)激刺激的動(dòng)物相比于未受刺激的動(dòng)物，其胚胎存活率降低19%。可見，應(yīng)激會(huì)使雌性哺乳動(dòng)物繁殖系統(tǒng)出現(xiàn)季節(jié)性排卵、反射性排卵等各種現(xiàn)象[16]。

營養(yǎng)水平對(duì)綿羊的排卵率和產(chǎn)羔率有重要作用，排卵率與母羊的體尺體重有關(guān)。季斐等[7]研究發(fā)現(xiàn)薩福克羊體重與沖胚獲得的回收胚胎數(shù)呈顯著正相關(guān)，同時(shí)采食量可能也是影響卵泡、胚胎生長速率的關(guān)鍵因素。營養(yǎng)不足會(huì)導(dǎo)致家畜生殖器官發(fā)育受阻和機(jī)能發(fā)生紊亂，延遲青年母畜的初情期，導(dǎo)致成年母畜發(fā)情抑制、發(fā)情不規(guī)律等情況發(fā)生，甚至?xí)黾釉缙谂咛ズ统跎行蟮乃劳雎剩欢鵂I養(yǎng)過剩會(huì)引起母畜卵巢、輸卵管及子宮等脂肪沉積過厚，不利于卵泡發(fā)育、排卵、受精及受精卵的運(yùn)行，也阻礙了妊娠子宮的擴(kuò)張和胎兒發(fā)育[17]。減少應(yīng)激反應(yīng)對(duì)超數(shù)排卵操作十分重要，在實(shí)際中FSH 減量法應(yīng)用較多，效果穩(wěn)定，但由于注射操作繁瑣且需要多次注射和多次保定都可能會(huì)引起應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生，存在一定風(fēng)險(xiǎn)[18]。超數(shù)排卵在制定FSH 遞減法時(shí)應(yīng)根據(jù)激素產(chǎn)品選擇使用濃度，并且需要根據(jù)不同品種對(duì)外源性激素敏感度的不同來進(jìn)行藥品和總劑量的選擇。在母羊保定過程中，采用一些降低母羊應(yīng)激反應(yīng)的設(shè)施和措施，適當(dāng)避開極端天氣的干擾等，能有效降低母羊應(yīng)激反應(yīng)給超數(shù)排卵結(jié)果帶來的影響。

本研究還建立了血清中蛋白含量對(duì)回收總卵數(shù)的最優(yōu)回歸方程，通過逐步回歸發(fā)現(xiàn)入選的自變量僅有總蛋白，參考黃琳琳[19]研究中用到的Curve Estimation 方法，本研究構(gòu)建出總蛋白對(duì)回收總卵數(shù)的不同回歸模型，根據(jù)決策系數(shù)R2越接近1，模型越接近真實(shí)值的原則[20]，得到最優(yōu)回歸模型y=137.571－2.971x+0.016x2，為生產(chǎn)中利用血清生理指標(biāo)評(píng)估回收總卵數(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，薩福克羊血清中總蛋白、白蛋白濃度與回收總卵數(shù)、可用胚胎數(shù)均存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，球蛋白濃度與回收總卵數(shù)存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，高回收總卵數(shù)組的總蛋白、白蛋白、球蛋白濃度極顯著低于低回收總卵數(shù)組，說明高回收總卵數(shù)組具有較低的蛋白濃度。總蛋白、球蛋白等血清生理指標(biāo)升高會(huì)導(dǎo)致超數(shù)排卵效果下降，故而要避免引起羊只產(chǎn)生炎癥反應(yīng)或過大的應(yīng)激反應(yīng)，以減少免疫球蛋白增加。同時(shí)本研究建立了最優(yōu)回歸模型y=137.571－2.971x+0.016x2，可利用血清中總蛋白評(píng)估回收總卵數(shù)。