CD81、CCL26 基因在黔北麻羊不同性腺組織中的表達研究

惠茂茂，周志楠，敖 葉，唐 文，洪 磊，陳 祥*

（1.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025）

黔北麻羊是貴州三大地方山羊品種之一[1]，屬短毛皮肉兼用品種，具有適應性強、繁殖率高、產肉性能良好等優點[2]。四跨膜蛋白超家族（TM4ST）是一組分子量在20～50 ku 的細胞膜蛋白[3]。CD81S屬于四跨膜蛋白超家族，是細胞內外信號傳遞的重要橋梁。根據自身具有的黏附效應，CD81在卵母細胞發育過程中發揮至關重要的作用。聶青和[4]研究發現在不同孕期胎盤絨毛組織中CD81基因的表達量不相同。據相關研究發現，CD81基因參與卵泡發育及排卵的調控過程[5]。此外，CD81基因也在大腦發育[6]、神經視網膜細胞的介導[7]、丙型肝炎病毒（HCV）感染[8]等方面也發揮相當大的作用。

趨化因子是一類目前為止數量最多、具有趨化吸引性的蛋白分子，在腫瘤的發展和轉移有著重要作用[9]。CCL26基因是趨化因子中的一類，在嗜酸性粒細胞表面表達量最高[10-11]。有研究表明，趨化因子CCL26基因與結腸癌的轉移有重要關聯[12]。趨化因子對妊娠也影響甚大。在子宮內膜被侵入滋養細胞過程中趨化因子可促血管生成因子，直接影響胎盤發育[13]。目前CCL26基因與動物繁殖性能的相關研究較少。本實驗旨在探究趨化因子對動物性腺細胞的直接或間接影響表達，以單、多羔黔北麻羊為研究對象，通過檢測CD81、CCL26基因在組織中的差異表達量，為進一步探討2 個基因對山羊繁殖的影響提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由貴州省習水縣富興畜牧業開發有限公司提供6 只健康單、多羔黔北麻羊母羊，進行屠宰后分別采取下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢5 個部分性腺組織，液氮保存運回實驗室備用。

1.2 實驗試劑 TRIzol@Reagent 試劑盒購自貴州綠盟英創生物科技有限公司；熒光定量試劑q-PCR Mix 購自擎科生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 移液槍：德國Eppendprf 公司；紫外可見分光光度計，購自美國Thermo Fisher 有限公司；電泳儀（DYY-2C 型），購自北京市六一儀器廠；PCR 擴增儀（C1000 TouchTM）、實時熒光定量PCR 儀（型號為CFX96 Real-Time System）、凝膠成像系統（Universal Hood Ⅱ），均購自美國BIO-RAD 有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 引物設計 根據GenBank 公布的山羊CD81基因序列（登錄號： NM_001285676.1）；CCL26基因序列（登錄號：XM_005697796.3）利用Primer Premier 5.0 軟件進行引物設計，將β-actin作為內參基因。設計引物后交上海生工生物工程技術服務股份有限公司合成。引物基本信息見表1。

表1 黔北麻羊CD81、CCL26 引物信息

1.4.2 RNA 的提取 根據TRIzol@Reagent 試劑盒說明書分別提取下丘腦、垂體、子宮、輸卵管、卵巢5 個組織中RNA。并用超微量分光光度計測定其濃度和純度，將峰圖單一、曲線平滑、OD260/OD280比值在1.8～2.0 的RNA 保存于-80℃冰箱，用于后續逆轉錄實驗。

1.4.3 cDNA 的合成 采用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉錄試劑盒將提取的RNA 逆轉錄合成cDNA 第一鏈。反轉錄體系的體積為20 μL：dNTP mix（2.5 mmol/L Each） 4 μL，Primer mix 2 μL，RNA 模板2 μL，5×RT Buffer 4 μL，DTT（0.1 mol/L） 2 μL，HiFi Script 1 μL，RNase-Free ddH2O 5 μL。PCR 反應條 件為42℃孵育50 min，85℃孵育5 min 于-20℃冰箱保存。

1.4.4 實時熒光定量q-PCR 10 μL 反應體系：cDNA 模板1 μL，SYBR Premix Ex Taq TM 酶（2×）5.5 μL，上、下游引物（10μmol/μL）各0.5 μL，ddH2O 2.5 μL。q-PCR程序：95℃預變性 1 min，95℃變性15 s，退火15 s，60℃延伸32 s，39 個循環，熔解曲線由機器自動設置，每個實驗設計3 個重復并設置陰性對照。

1.4.5 統計分析利用2-ΔΔCt相對定量法[14]計算目的基因的相對表達量。使用SPSS 23.0 軟件中One-Way ANOVA 進行單因素方差分析，使用LSD 法進行差異顯著性檢驗，試驗結果采用平均值± 標準差來表示，P＜0.05 為差異顯著性判斷標準，以P＜0.01 作為差異極顯著性的判斷標準。

2 結果

2.1CD81、CCL26基因的擴增黔北麻羊CD81、CCL26基因擴增結果如圖1 所示。經過PCR 擴增，CD81基因大小為129 bp，CCL26基因大小為167 bp。與預測片段大小一致，且條帶清晰、單一，無非特異性擴增，證明目的基因CD81、CCL26熒光定量引物特異性良好，可做下一步實驗研究。

圖1 CD81（A）、CCL26（B）基因擴增圖像

2.2CD81、CCL26基因在黔北麻羊單、多羔不同性腺中表達分析

2.2.1CD81基因在黔北麻羊單、多羔不同組織的表達分析 如圖2 所示，CD81基因在黔北麻羊單、多羔5 個組織中均有不同程度表達。在單羔組內，CD81基因在卵巢中的表達量最高，其次為輸卵管、垂體、下丘腦，在子宮中的表達量最低；在卵巢中的表達量極顯著高于其他組織；垂體、輸卵管表達量極顯著高于下丘腦、子宮。在多羔組內，CD81基因在卵巢中的表達量最高，其次為垂體、子宮、輸卵管，在下丘腦中的表達量最低；卵巢表達量極顯著高于其他組織；垂體與輸卵管、下丘腦表達量差異極顯著。CD81基因mRNA 在子宮多羔組中的表達量顯著高于單羔組，其余組間無顯著差異。

圖2 CD81 基因在黔北麻羊單、多羔不同組織中的表達

2.2.2CCL26基因在黔北麻羊、多單羔不同組織的表達分析 如圖3 所示，CCL26基因在黔北麻羊單、多羔不同組織的表達量各不同。單、多羔組均在卵巢組織表達量最高，下丘腦表達量最低；單羔中各組織的表達量普遍高于多羔。單羔組內，CCL26基因在卵巢、輸卵管和子宮的表達量極顯著高于下丘腦和垂體表達量。多羔組內，CCL26基因在卵巢、輸卵管組織表達量極顯著高于下丘腦、垂體、子宮，在垂體、下丘腦、子宮間差異不顯著。CCL26基因在單羔組子宮的表達量極顯著高于多羔組；在單羔組輸卵管和卵巢的表達量顯著高于多羔組。

3 討 論

圖3 CCL26 基因在黔北麻羊單、多羔不同組織中的表達

3.1 各組織中CD81基因表達量的變化情況CD81是機體內分布廣泛、參與各種生理應答的跨膜蛋白分子，在信號轉導、抗原呈遞、細胞融合等機制中發揮重要作用，目前對于這一基因的研究越來越廣泛[15]。有研究證明慢性肝病的發生是由于丙型肝炎病毒（HCV）感染導致的，其中CD81基因直接或間接參與了整個病毒感染機制的發生[16]。Rubinstein 等[17]研究發現，在小鼠卵母細胞表面，CD81基因與富含跨膜蛋白的膜相關聯，缺乏CD81基因會導致小鼠雌性的生育能力缺陷。湯繼順等[18]對小尾寒羊和蘇尼特羊進行實驗時發現，CD81基因在14 種組織中均有高表達，小尾寒羊性腺組織中下丘腦表達量最高，蘇尼特羊卵巢表達量最高，在精卵質膜融合過程中起重要作用。何柳等[19]實驗發現，CD81基因除了在性腺組織中高表達外，還在以獼猴為模型的肝臟、脾臟淋巴結等組織中顯著表達。Ohnami 等[20]通過小鼠免疫細胞化學分析表明，CD81廣泛分布在卵母細胞細胞膜外，參與精子卵母細胞的融合。Jankovicova 等[21]在比較豬和牛卵母細胞中CD81的定位過程中發現，此基因在卵母細胞成熟和胚胎早期發育過程能夠高度表達。本實驗發現，CD81基因在黔北麻羊單多羔中都有表達，CD81基因在單多羔卵巢組織表達量最高，且均極顯著高于其他組織，這與相關實驗結果[17-18,20]一致。據相關研究證明，CD81基因的過表達可提高小鼠的受精率[22]。因此可以推斷，山羊的繁殖力與CD81基因有著重要關聯，尤其是卵巢組織中。CD81基因參與山羊精卵融合相關的機制推測還需進一步證實。

3.2 各組織中CCL26基因表達量的變化情況CCL26作為嗜酸性粒細胞趨化因子，通過CCR3受體發出信號[23]，而CCR3除了在嗜酸性粒細胞表達外，還在絨毛滋養細胞、合胞體滋養細胞和EVT 等表達[24]。由此猜測CCL26對于滋養層細胞有作用。Chau Simon 等[25]證明了CCL26在子宮中高表達，調節子宮蛻膜螺旋小動脈的重塑過程，影響妊娠過程。Dominguez 等[26]從原代上皮子宮內膜細胞收集的條件培養基中發現CCL26的存在，表達量極高。

EoE 患者的活檢物中CCL26表達顯著增加，并且單核苷酸多態性與疾病發病率增加相關[27]。Caselli 等[28]在女性原發特異性不孕的實驗中發現子宮內膜細胞上CCL26基因表達量升高。還有實驗證明CCL26基因在發情周期的第0、3、7 天在子宮內膜中表達且第0天表達量最高[29]。本實驗發現，在黔北麻羊性腺組織中CCL26的表達量不同，在卵巢中表達量最高，下丘腦表達量最低，垂體、子宮、卵巢表達量居中。目前CCL26基因引發炎癥反應的研究居多，而在性腺組織的相關性研究較少，尤其是在動物為模型的相關實驗。本實驗CCL26基因子宮也在山羊中高表達，與Chau Simon 等[25]、Dominguez 等[26]研究結果一致。通過CCL26在性腺組織中的表達量高低推測CCL26可能調控山羊的繁殖，但具體機理有待進一步研究。

4 結 論

通過對黔北麻羊下丘腦、垂體、子宮、輸卵管、卵巢5 個組織CD81和CCL26基因的熒光定量分析，表明2 種基因在山羊單多羔中都有不同表達，在卵巢中表達量最高；CD81在單羔下丘腦組織、雙羔下丘腦組織表達量最低，CCL26在單多羔下丘腦組織表達量最低。CCL26基因在單羔組子宮的表達量極顯著高于多羔組。結果證明2 種基因可能影響性腺發育，參與山羊繁殖調控，為進一步研究基因功能提供依據。