胃腸道褪黑素的合成及其對消化道微生物群體影響的研究進展

2021-01-20 08:08:50歐陽佳良陳培根王夢芝

中國畜牧雜志 2021年1期

關鍵詞：小鼠

薛純，歐陽佳良，陳培根，王夢芝

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225000）

褪黑素（Melatonin，MT），即N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是一種普遍存在于大自然的多功能分子，在單細胞生物、植物、真菌和動物中都具有功能活性[1]。MT 是一種吲哚類激素，主要是由機體的下丘腦視交叉上核的松果體分泌[2]。松果體作為神經內分泌傳感器在光/ 暗周期的黑暗階段分泌MT，因此，MT 也被稱為黑暗激素[3]。研究發現，MT 在抗氧化、調節免疫等方面起重要作用[4]。

有研究發現，胃腸道也能合成分泌大量的MT，并在調控胃腸道動力、炎癥和抗氧化等方面發揮積極作用[5]。動物胃腸道中存在大量共生微生物，部分具有振蕩節律的腸道微生物可驅動宿主晝夜節律轉錄、表觀遺傳和代謝物振蕩[6]。MT 可作為一種信號分子參與腸道微生物之間的通訊，通過釋放細胞調節因子來影響微生物群落結構及其代謝產物。腸道細菌通過MT 結合位點識別并響應來自腸道的MT 信號，進一步激活腸道免疫細胞的功能[7-8]。MT 通過NF-κB 信號轉導協同參與免疫調節，并影響微生物代謝的晝夜時鐘[9]。但目前MT 在腸道內進行信號轉導的通路尚未明確，了解MT 如何在細菌產生的炎癥信號下介導腸黏膜免疫細胞的活化與增殖，以及微生物通過何種信號途徑參與MT 免疫調節具有重要意義。本文綜述了近年來MT 在胃腸道中的分泌合成、晝夜節律性、胃腸道微生物代謝的節律性以及MT 與胃腸道微生物的節律互作影響的研究，為進一步研究闡明MT 與胃腸道微生物群體節律變化提供一定參考。

1 胃腸道MT 的合成與分布

早期研究認為，MT 是由哺乳動物下丘腦視交叉上核（SCN）的松果體合成分泌的一種胺類激素[10]。機體SCN 損傷會喪失晝夜節律，而移植SCN 可以恢復損傷SCN 動物的晝夜節律[11]。SCN 作為機體的核心生物鐘系統，可通過多接觸交感神經通路抑制或激活松果體合成MT[12-13]。MT 的分泌具晝夜節律性，一般呈現晝低夜高的趨勢，在02:00—03:00 分泌量達到峰值[14]。在松果體中，以色氨酸為原料，在色氨酸羥化酶（TPH）作用下轉化為5-羥基色氨酸；在5-羥基色氨酸脫羧酶（5-HT-POC）催化下成為5-羥色胺（5-HT）；在N-乙酰轉移酶（NAT）作用下轉化為N-乙酰-5-羥色胺；最后在羥基吲哚-氧位-甲基轉移酶（HIOMT）作用下生成MT[14]。

近20 年來，越來越多的研究發現MT 除了由松果體分泌外，在視網膜[15]、皮膚[16]、淋巴細胞[17]、骨髓[18]、胃腸道[19]等組織中也可以被合成分泌。胃腸道是產生MT 的重要場所之一，主要是由胃腸道黏膜的腸嗜鉻細胞（Entero Chromaffin Cell，EC）分泌，EC 中含有大量的5-HT 和MT[20]。人類胃腸道 EC 細胞含有大量的MT 受體，且MT 受體含量高于5-HT[21-22]。胃腸道與松果體雖然分泌MT 機制不同，但都具晝夜節律性[23]。胃腸道MT 的合成主要是以色氨酸為原料，在色氨酸羥化酶（TPH）作用下合成5-羥色氨酸；5-羥色氨酸通過芳香族L-氨基酸酶（AADC）脫羧生成5-HT；5-HT分別以2 種途徑分泌生成MT：其一，在5-羥色胺-N-乙酰轉移酶（SNAT）作用下轉化成乙酰5-羥色胺，最后通過N-乙酰血清素-O-甲基轉移酶（ASMT）生成MT；其二，5-HT 在ASMT 作用下轉化成5-甲氧基色胺，最后在SNAT 作用下生成MT[24]。

在胃腸道不同部位，MT 含量不同。大鼠胃腸道中MT 含量最高的是十二指腸（主要在上皮細胞），回腸中也檢測到MT，而空腸幾乎不含MT；越接近直腸，MT含量越高（主要在上皮細胞中）[25]。Muoz-Pérez 等[26]在虹鱒魚的研究中也有類似的發現，在虹鱒魚食道到后腸不同位置均檢測到MT，摘除松果體后發現，胃腸道中仍可以合成MT 且MT 生物合成酶基因aanat1、aanat2和hiomtmRNA 呈節律性表達。這說明一部分胃腸道MT 是不依靠于松果體分泌的，分泌的MT 呈節律性表達。Steful 等[27]在小鼠試驗中，通過檢測MT 生物合成關鍵酶SNAT 和HIOMT 的組織特異性表達，在小鼠腸道中發現了MT 合成關鍵酶的基因表達，其結果說明胃腸道可以通過自身合成分泌MT，進一步維持胃腸道內MT 濃度的穩定性。除了哺乳動物、單胃動物外，在反芻動物胃腸道中也發現MT 的存在。檢測奶牛胃腸道各部位MT 含量，發現瘤胃和回腸中MT 含量較其他組織顯著升高，說明MT 在反芻動物胃腸道各部位中的水平和分布也具有特異性和差異性[28]。目前，在反芻動物中關于MT 在胃腸道具體的調控機制以及通路的相關研究幾乎沒有，仍需進行大量的研究。

另外有研究發現，動物機體胃腸道中主要有2 種MT 特定受體MT1（MT1a）和MT2（MT1b），都屬于G 蛋白偶聯受體家族，在納摩爾范圍內具有高親和力[29]。MT3 是從MT2 分離出的一個假定的強親和性MT 結合點，是醌還原酶QR（2），與細胞的異種代謝有關[30]。小鼠十二指腸、結腸存在MT1 mRNA轉錄物[31]及MT2 mRNA 轉錄物，其中，十二指腸中MT1 mRNA 表達較高；結腸中，MT2 mRNA 表達較高[32]。除十二指腸外，小腸的其他部位也存在MT1 和MT2 mRNA 轉錄物[33]。人類胃腸道中的直腸、結腸、十二指腸、肌間神經叢、胃腸道血管和胰腺組織均含有MT1、MT2 受體表達[34]。

2 MT 在胃腸道中的生理功能

2.1 調節胃腸道運動 MT 參與調控動物機體采食及消化過程，調節胃腸運動。限制小鼠飲食能夠增加小鼠腸道中MT 濃度，禁食可增加小鼠小腸黏膜中EC 數量，從而提高MT 濃度[35]。體外研究發現，添加MT 后，大鼠小腸以及結腸的自發性收縮力減小[36]。通過給小鼠腹腔注射不同劑量的MT，發現低劑量MT 促進小腸運動，而高劑量起抑制作用；非選擇性MT 受體拮抗劑Luzindole 可減弱MT 引起的腸肌電活動[37]。由腸黏膜內分泌細胞釋放膽囊收縮素（CCK），可激活迷走神經傳入纖維末梢上的CCK1 受體，進而啟動迷走神經-迷走神經反射對胃運動功能的抑制[38]。MT 可激活腸內分泌細胞釋放CCK，通過CCK1 受體啟動胃排空的迷走神經-迷走神經抑制[39]。進行MT 治療后，可恢復被切除松果體大鼠的回腸運動[40]。這些研究表明MT 通過中樞神經系統參與了CCK 對腸道運動的調節作用。

2.2 抗氧化作用 MT 作為一種特殊的抗氧化劑，在胃腸道中參與調控胃腸道動力、炎癥和抗氧化[41]。MT 在體外具有給電子能力，可減少自由基；MT 除了通過細胞膜上和細胞核內的受體發揮作用外，還可以與潛在的損傷因子直接相互作用[42]。MT 不僅在水溶液中具有清除羥基自由基（·OH）能力[43]，在脂質環境中也具自由基清除劑的作用，可以自由通過生理屏障[44]。MT 通過5-甲氧基直接清除·OH、過氧化氫（H2O2）、一氧化氮（NO˙）[45]等氧自由基。在MT 抗氧化聯級反應中，MT 清除2 分子·OH 后形成的代謝產物之一是3-羥基褪黑素（C-3-OHM）[46]。有研究表明通過電離輻射刺激大鼠，使大鼠血液產生大量的·OH，尿中C-3-OHM 含量顯著增加，表明C-3-OHM 含量可做吲哚胺自由基解毒的指標，MT 可作為·OH 清除劑作用的一個足跡[46]。MT 逐步進行級聯反應生成的N1-乙酰基-N2-甲酰基-5-甲氧基犬尿氨酸（AFMK）和N1-乙酰基-5-甲氧基犬尿氨酸（AMK）都是自由基清除劑。這一系列反應大大提高了MT 抗氧化的效果[47]。馬玉娥等[48]在黃羽肉雞飼糧中添加色氨酸，血清中谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）含量和總抗氧化力（T-AOC）升高，說明作為MT 前體物的色氨酸可增強肉種雞的抗氧化能力。Dan 等[49]通過MT 治療結腸炎小鼠，小鼠血清中抗壞血酸量顯著增加，說明MT 能提高結腸炎小鼠的抗氧化能力。

2.3 免疫調節作用 MT 可以通過受體依賴性和非依賴性途徑對腸黏膜進行免疫調節。MT 受體依賴性途徑有3 種受體參與[50]，分別為MT、ROR（孤核受體亞家族，是免疫平衡的重要調節因子）和RZR（維甲酸Z 受體）；非依賴性途徑存在于細胞質和線粒體中的各種結合域，如鈣網蛋白、QR（2）。胃腸道MT 除了清除羥自由基、增強免疫以及抗氧化作用外，還可以增加黏膜血流量和調節糞便含水量等[51]。T 細胞通過與褪黑素受體結合來調節免疫反應，T 細胞含有合成MT 所需的4種酶（AADC、TPH、ASMT 和SNAT）和4 種褪黑素受體（MT1、MT2、RZRβ和RORα、β、γ），AADC和TPH 參與T 細胞5-HT 的形成[52]。其中，ASMT基因在Th 細胞和細胞毒性T 細胞中強烈表達[53]。SNAT和ASMT 的激活導致大量MT 的釋放，ASMT 或TPH的抑制相應降低MT 含量[54]。不僅如此，MT 還能控制T 細胞的活化、分化和增殖，其調節作用包括：降低IFN-γ的產生，抑制Th1 的分化；增加IL-4 和IL-10 的產生，促進Th2 的分化；抑制Th17 細胞的分化[55]。添加MT 可導致淋巴結Th17 細胞數量降低，伴隨著一些炎癥因子的減少，如IL-1β、IL-6，促進T17 細胞的分化，這表明MT 有助于抗炎作用[56]。

3 胃腸道微生物及其節律性

腸道微生物與宿主健康有著不可分割的聯系。胃腸道菌群可以提高機體免疫力，參與營養物質吸收代謝從而維持機體健康[57]。腸道菌群還有助于形成抗癌免疫反應，有助于更好地治療某些癌癥，如結直腸癌[58]。腸道微生物數量眾多，但并非都是有益于機體代謝。研究發現，將患乳房炎的奶牛糞便移植給無菌小鼠，無菌小鼠感染乳房炎，表明某些腸道微生物群也能危害機體健康[59]。

胃腸道在許多生理功能上表現出晝夜節律性。在其每個細胞中，節律性轉錄程序由核心時鐘轉錄因子網絡執行，如周期（Per）、隱色素（cryptochrome）、Bmal和Clock，這些因素控制著晝夜節律啟動子處表觀遺傳標記的節律性變化[60]。通過檢測大鼠結腸上皮細胞中節律基因的表達，發現Per1、Per2、Cry1、Bmal1、Clock、Rev erbα、NHE3的表達及Per1、Bmal1蛋白的表達均呈晝夜節律性[61]。除了腸道上皮細胞具有晝夜節律，最近還在哺乳動物胃腸道內發現定植的細菌群落也會經歷晝夜振蕩，大腸中細菌在定位和分泌代謝物方面都具節律性[62]。腸道微生物呈現出自己的生物鐘模式，在關鍵代謝介質中產生振蕩，這些介質被整合到宿主的晝夜節律中，維持代謝內環境的穩定[63]。還有研究證明，真菌和藍細菌也存在晝夜節律。例如，藍細菌中的起搏器通過振蕩日光信號轉導來調節基因表達以及時間細胞分裂[64]。Liang 等[65]在細菌基因組豐度水平上觀察野生型小鼠糞便微生物群的晝夜節律，發現雄性小鼠糞便中的細菌總數比雌性小鼠多，但雌性小鼠比雄性小鼠表現出更顯著的晝夜振蕩；通過16S rRNA 基因拷貝數測量的糞便細菌負荷，發現擬桿菌的絕對豐度在白天波動，而厚壁菌的絕對豐度僅隨時間略有波動；另外，蛋白質細菌的絕對豐度是振蕩的。此外，有學者利用綜合多組學和影像學的方法，證明了腸道微生物群具有振蕩的生物地理分布和代謝組模式，這種模式決定了腸道上皮細胞在一天內對不同細菌及其代謝產物的節律性；反過來，這種晝夜微生物行為驅動宿主晝夜節律轉錄、表觀遺傳和代謝物振蕩[66]。Per1和Per2基因是宿主生物鐘的關鍵組成部分，而Per1和Per2基因被切除后，微生物群節律性大多喪失，刪除Bmal1可消除糞便微生物群的晝夜振蕩[67]。由此可知，宿主核心時鐘中的激活基因（Bmal1）和抑制基因（Per1、Per2）可引起糞便微生物群組成振蕩，進一步說明了宿主生物鐘與微生物節律性的聯系。穩態微生物群節律性的破壞不僅使宿主的正常染色質和轉錄振蕩消失，也會在腸道中激發全基因組的從頭振蕩，從而影響宿主生理以及對疾病的易感性[66]。

4 MT 與腸道微生物的調控關系

4.1 MT 對腸道微生物及其代謝的影響腸道微生物群體變化和MT 之間的相互聯系逐漸成為研究熱點。Xu等[68]研究發現對雄性小鼠灌注MT 顯著降低腸道厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）比例，增加阿克曼氏菌（Akkermansia）的相對豐度，減少了腸道微生物群的數量，降低了腸道微生物群的豐富性和多樣性；表明小鼠體內MT 可以通過改變腸胃微生物區系結構從而抑制肥胖，對調節胰島素抵抗、肝脂肪變性和低級炎癥有積極作用。Ren 等[69]比較患結腸炎小鼠和MT 治療結腸炎小鼠，發現MT 組小鼠的抗氧化能力明顯強于結腸炎小鼠，且兩試驗組微生物最豐富類群發生改變（如乳酸菌的豐度增加），但兩組在多樣性指數（Shannon 和Simpson）、細菌培養豐度（Chao1 和ACE）和覆蓋率（Good's coverage estimator）方面沒有顯著差異。此研究結果支持MT 對結腸炎小鼠抗氧化能力和微生物群的調節作用，有助于預防腸道疾病，改善腸道健康。

營養物質顯著影響微生物代謝物的產生和規模，微生物代謝物在動物機體的腸道和相關的黏膜免疫系統中大量存在，通常是具有生物活性的小分子[70]。作為MT 的前體物，色氨酸通過乳酸桿菌代謝，產生吲哚-3-醛，吲哚-3-醛可與芳香烴受體（AHR）結合，然后由含有血管緊張素轉換酶2（Ace2）的轉運體通過上皮細胞層轉運[71]。Tatsuo 等[72]研究發現，Ace2 可控制腸道中性氨基酸水平，其中包括Trp；當小鼠體內Ace2缺乏，可導致腸道炎癥易感性增高和腸道微生物組成改變，通過添加色氨酸可以平衡微生物菌群。腸道微生物群通過膳食纖維發酵產生許多代謝物，其中包括短鏈脂肪酸（SCFAs）。部分腸道微生物（如屬于丁基里維布菌屬、梭狀芽孢桿菌屬和真細菌屬的細菌）也可產生SCFAs，并被微生物群利用[73]。微生物產生的SCFAs能夠激活腺苷5'-單磷酸活化蛋白激酶，從而誘導線粒體的生成[74]。作為原始需氧多態性細菌后代的線粒體，是真核細胞合成MT 的重要場所[75]。真核細胞代謝產生的SCFAs 介導了許多重要的功能，其中包括為腸上皮細胞供能以及參與T 細胞、調節性T 細胞（Tregs）、樹突狀細胞和巨噬細胞的多種免疫信號通路[76]。因此，可以假設MT 作為一種信號，參與腸道微生物群線粒體代謝。

4.2 MT 對腸道微生物調控的機制

4.2.1L-色氨酸（Trp）代謝對腸道微生物的影響人類胃腸道中的產氣腸桿菌對胃腸道分泌的MT 敏感，其在群集以及運動模式上表現出晝夜節律性。研究發現，肺炎克雷伯菌和大腸桿菌，以及實驗室培養的大腸桿菌中沒有表現出明顯的成群結隊的模式（蜂群），而當添加MT 后大腸桿菌和肺炎克雷伯菌培養物中，蜂群數量增加[21]。利用motA啟動子驅動luxCDABE 構建，將產氣大腸桿菌培養物轉化為表達熒光素酶，通過檢測培養物發光量發現，未添加MT 的產氣腸桿菌的晝夜節律是高度可變的；然而在1 nnmol/L MT 存在下，這些節律的相位同步[77]。證實了產氣腸桿菌與NF-κB 依賴性熒光素酶活性的晝夜節律變化相關，產氣腸桿菌對MT的敏感性是通過其大規模的蜂群節律變化而表現出來的，表明人類生物鐘系統可能通過攜帶細菌鐘來調節其微生物群[78]。因此，推測MT 可能是一個宿主信號，影響腸道微生物群和介導宿主適應性免疫活動，但其具體調節機制不清晰。

作為營養增強劑的Trp 在維持腸道免疫耐受和腸道微生物群的平衡中起著至關重要的作用。最近研究發現，Trp、內源性Trp 代謝物（酪氨酸、5-HT 和MT）和細菌Trp 代謝物（吲哚、吲哚酸和色胺）對腸道微生物組成、微生物代謝有著深遠的影響[79]。其中有1%～2%Trp 通過5-HT 途徑轉化為5-HT 和MT。通過研究MT對腸道微生物群的影響發現，腸道微生物決定Trp 對機體的有效性，其中氨基酸代謝物尤其受到影響。例如，Trp 通過細菌介導，生成含吲哚的生物活性代謝物，其中硫酸吲哚和抗氧化劑吲哚-3-丙酸（IPA）受到影響[80]。IPA 的產生完全依賴于腸道菌群的存在，可以通過產孢梭菌的定植來建立。Trp 在腸道致孢梭狀芽孢桿菌和瘤胃球菌共同作用下脫羧生成色胺；吲哚乙酸可以被腸道中的乳酸桿菌、梭狀芽孢桿菌、類桿菌等脫羧轉化為3-甲基吲哚（圖1）。這些研究都表明Trp 及其代謝產物與腸道微生物群之間可以相互影響，而Trp 及其代謝物與MT 合成代謝息息相關，因此，MT 有可能通過Trp代謝通路調控腸道微生物。

圖1 腸道內與微生物群相關的色氨酸代謝[80]

4.2.2 多種微生物成分通過NF-κB 和STAT1 等細胞內信號途徑參與MT 對免疫系統的調節包括脂多糖（LPS）和淀粉樣β肽（Aβ）在內的多種微生物成分通過NF-κB 和STAT1 等多種細胞內信號途徑參與MT 對免疫系統的調節。NF-κB 是NF-κB 亞基家族的一種二聚體，包括常見的二聚體p50、p65（也稱為Rel-a）、P52、Rel-c 和Rel-b[81]。活化的NF-κB 二聚體從細胞質轉運到細胞核，與靶基因的啟動子區（如iNOS 和IL-6）連接，從而刺激NF-κB 二聚體的轉錄。大多數細菌和TLR（細胞表面受體）結合，可以刺激NF-κB 信號通路，改變各種促炎癥介質的表達。作為腸道中最主要的革蘭氏陰性菌，擬桿菌約占腸道細菌的30%，它可以分泌促炎癥神經毒素，包括LPS、毒性蛋白水解肽和Aβ[82]。在松果體中，Aβ激活NF-κB 通路，使腺體產生應激反應，損害MT 產生。Aβ還通過MT 受體MT1 和MT2 來影響MT 信號傳導，Aβ顯著減少了MT1 結合位點的數量。Aβ對松果體功能的影響是通過誘導和抑制MT 合成來加以影響。這揭示了松果體和MT 系統之間的雙向相互作用，但需要進一步的研究來揭示Aβ調節MT 受體功能的確切機制[83]。LPS 是革蘭氏陰性菌表面的細胞壁成分，LPS 可激活多種細胞內信號通路，如TOLL 樣受體刺激NF-κB 下游，從而促進iNOS 熱休克蛋白的表達[84]。作為擬桿菌一種的中間芽孢桿菌，從中間芽孢桿菌中提取的LPS 不同于從腸桿菌科（包括大腸桿菌和沙門氏菌）中提取的傳統LPS，從中間芽孢桿菌中提取的LPS 可以刺激巨噬細胞產生炎癥介質，如免疫細胞中的NO 和IL-6。MT 通過減少核移位和抑制NF-κB 的p50 活性，有效地阻斷了芽孢桿菌LPS 誘導的NF-κB 信號傳導[83]。除NF-κB 外，STAT 信號通路也參與炎癥反應。STAT1、STAT2、STAT3、STAT4和STAT6 是STAT 蛋白家族的成員，在調節促炎和抗炎反應中起轉錄因子的作用[85]。

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