巨噬細胞對Fah 基因剔除小鼠肝細胞移植效率的影響

唐善花 周徐 于學波 曹丹 唐亮 郭琳娜 黃珊娜

（1 海軍軍醫大學東方肝膽外科醫院信號轉導實驗室 上海 200438）

（2 上海交通大學附屬仁濟醫院麻醉科 上海 200127）

（3 海軍軍醫大學附屬東方肝膽外科醫院病理科 上海 200438）

細胞移植是治療肝病的有效手段之一，目前在肝衰竭和代謝性肝病臨床應用中具有較為突出的治療效果。現階段全世界有近百位的患者進行了肝細胞治療，大部分患者臨床癥狀得到改善或者成功接受肝移植[1]。盡管短期療效顯著，肝細胞移植臨床應用的最大挑戰在于細胞移植后再生效率問題。細胞在體內的再生主要是細胞與周圍環境共同作用的結果。而肝臟微環境主要由非實質細胞及其分泌因子構成，Kupffer 細胞是肝臟內主要的非實質細胞來源，其數量占肝臟細胞總體數量的15%，同時具備多樣的生物學功能，參與肝臟正常合成代謝、肝臟疾病的發生發展等過程[2]。目前Kupffer 細胞在肝臟再生過程中的作用仍然存在較大的爭議，有研究人員在肝切的模型中證明清除Kupffer 細胞后會延遲肝再生的過程[3]，也有人證明清除Kupffer 細胞后加速肝再生的過程[4]。體內肝再生的過程往往伴隨著肝損傷，然而沒有研究深入探討Kupffer 細胞是否對肝損傷及肝細胞移植的效率有所影響。本研究采用Fah-/-小鼠模型模擬肝損傷及肝細胞移植過程，通過觀察Fah-/-小鼠撤藥后肝損傷過程中巨噬細胞的活化情況，并采用巨噬細胞清除或與肝細胞共同回輸的方式進行肝再生效率以及病理學變化評價。

1.材料與方法

1.1 材料

Fah-/-小鼠（129S4 品系，體重20 ～25g，10 周齡，63 只），Fah-/-小鼠受贈于第二軍醫大學基礎部細胞生物學教研室，繁育于第二軍醫大學信號轉導實驗室動物房，實驗前在此小鼠飲用水中加入7.5mg/L NTBC（4-對羥苯丙酮酸二氧合酶活性抑制劑）維持小鼠正常生存。野生型小鼠（體重20 ～25g，129S4 品系，10 周齡）6 只，均正常進食。

1.2 動物分組與處理

9 只Fah-/-小鼠用于NTBC 藥物撤除后觀察肝損傷與巨噬細胞活化過程（3 只/時間點）；10 只Fah-/-小鼠用于驗證脂質體清除巨噬細胞效果實驗（實驗組n=5，對照組n=5）；30 只Fah-/-小鼠用于巨噬細胞清除后肝細胞移植實驗（10 只/時間點，每個時間點實驗組n=5，對照組n=5），細胞移植后對照組與實驗組均撤除NTBC 藥物；4 只Fah-/-小鼠用于骨髓巨噬細胞的體外分離與培養；10 只Fah-/-小鼠用于巨噬細胞與肝細胞共同移植實驗（實驗組n=5，對照組n=5），細胞移植后對照組與實驗組均撤除NTBC 藥物；6 只野生型129S4 品系小鼠用于原代肝細胞的分離。

1.3 原代肝細胞分離與移植

采用原位兩步灌流法與梯度密度離心法分離獲得單個原代肝細胞后，采用臺盼藍染色法對肝細胞進行活率檢測，使細胞活率在80%以上；采用Hank's 液將細胞洗滌2 遍，離心參數50xg，5min；最后重懸于William's E 培養基中，肝細胞懸液密度調整為5×105/ml。將小鼠麻醉后，經小鼠肋下開口暴露脾臟，采用脾臟注射移植細胞，每只小鼠移植體積為200μl 左右的肝細胞懸液，肝細胞數目為1×105/只。對照組注射200μl 的William's E 培養基。

1.4 小鼠巨噬細胞分離與培養

將小鼠兩側后肢股骨進行體外分離，再剔除骨頭上多余的結締組織以及肌肉，用于防止其他組織內的巨噬細胞混入。用刀片切除股骨兩頭，1ml 注射器吸入1640 完全培養基（10% FBS，1%青-鏈霉素），從股骨的一段進行反復推注，直至骨髓沖洗完全。收集培養皿中細胞懸液，以40ng/ml 的濃度比例添加GM-CSF 細胞因子，刺激骨髓中單核細胞向巨噬細胞的轉化。經過12H 的培養后，收集未貼壁的細胞，重新將細胞接種入細胞培養皿中，每隔2 ～3d 換液1 次。

1.5 統計處理

再殖效率的評價采用Image J 軟件分析；其余數據使用GraphPad Prism 7 進行統計學分析，采用雙尾非配對t檢驗用于計算兩組平均值之間的統計學差異性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 Fah 基因剔除小鼠撤藥后肝臟損傷的同時伴隨著巨噬細胞的活化

Fah-/-小鼠是Grompe 等模仿人類遺傳型酪氨酸血癥I 型（hereditary tyrosinaemia type I，HTl）建立的模型小鼠。該小鼠由于Fah 基因的缺失，酪氨酸分解代謝受阻，導致酪氨酸中間代謝產物在體內的蓄積，從而引肝臟損傷。NTBC[2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基）-環己烷-1，3-二酮]可通過阻斷有害物質的生成從而維持Fah-/-小鼠的生存與肝功能。撤除NTBC 藥物后1 周、2 周、3 周，H&E 染色顯示小鼠肝臟組織結構逐漸紊亂，并且出現局灶性壞死。免疫組化F4/80 染色結果顯示，在此過程中伴隨著巨噬細胞數目的增加（圖1）。

圖1 Fah 基因缺陷小鼠肝損傷的同時伴隨著巨噬細胞的活化

2.2 清除巨噬細胞有利于提高肝細胞移植的重建效率

脂質體清除巨噬細胞的效率約為50%（圖2A）。清除巨噬細胞后進行肝細胞移植，分別在1 周、2 周和4 周時間點進行觀察。免疫組化Fah 染色與統計學顯示，在細胞移植后前2 周，對照組與清除巨噬細胞組沒有顯著差異，而第4 周時清除巨噬細胞組定植細胞的克隆數目與大小明顯多于對照組（圖2C，D）。這說明巨噬細胞影響肝細胞的定植與再植。

圖2 清除巨噬細胞有利于提高肝細胞移植的重建效率

2.3 Fah-/-小鼠骨髓巨噬細胞與肝細胞共同回輸不利于肝細胞的體內增殖

將Fah-/-小鼠骨髓來源的單核細胞進行體外分離與培養，并在GMSF 生長因子的刺激下將其定向分化為巨噬細胞，經流式細胞術鑒定，經體外培養誘導的巨噬細胞（F4/80+/CD11b+）純度為99.15%（圖3A，B）。將巨噬細胞與新鮮分離的原代肝細胞按1:5的比例混合，共同移植入Fah-/-小鼠脾臟中。5 周后免疫組化染色及統計學顯示，巨噬細胞與原代肝細胞混合組，肝臟重建比例明顯降低，肝損傷也更為嚴重（圖3C，D）。同時發現，巨噬細胞與原代肝細胞混合注射組的小鼠脾臟中，巨噬細胞特異標志物F4/80+細胞的數量明顯多于對照組（圖3E），由此我們認為巨噬細胞影響肝細胞移植過程中細胞在體內的增殖過程。

圖3 巨噬細胞與肝細胞回輸不利于肝細胞的體內增殖

3.討論

肝臟具有十分強大的再生功能，不管是急性還是慢性肝損傷中均存在肝細胞的再生。在急性肝損傷中，由各類非實質細胞，如肝星狀細胞、巨噬細胞等分泌的促肝再生信號分子，如IL-6、HGF 等分子會刺激肝細胞在短期內快速大量增殖，補充損失的肝細胞從而實現再生[2，5-6]，然而，在慢性肝臟損傷進程中，存在大量的炎性因子浸潤及其相關的信號網絡調控體系，如TNF-alpha 信號通路、FGF7、HGF 及EGF 等信號分子，這些信號可以促進肝前體細胞（liver progenitor cells，LPCs）的增生[7-9]。因此在體內，細胞實現增殖再生的過程實際上是由細胞與所處微環境共同作用的結果[10]。本研究通過實驗證明了巨噬細胞妨礙了肝細胞移植中肝再生的過程。然而本次研究沒有探討巨噬細胞通過何種機制阻礙了外源細胞的增殖過程，比如巨噬

細胞的吞噬作用或者分泌因子起到了潛在的關鍵作用，又或者不同亞群的巨噬細胞對于肝細胞移植效率的影響有可能有差異。研究巨噬細胞在肝再生過程中的作用有助于幫助我們重新認識肝臟再生的過程，解決肝細胞移植臨床應用的難題，本次研究有可能為臨床肝細胞移植提供新的策略和參考。