嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿測定的方法驗(yàn)證

石永倩 張?zhí)觳?/p>

【摘 要】為了驗(yàn)證采用分光光度法測定嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿含量方法的準(zhǔn)確性與可靠性，判斷測定結(jié)果是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求，文章采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測定》中的方法測定乳品中左旋肉堿的含量，并根據(jù)《合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》中的相關(guān)規(guī)定對其線性、線性范圍、檢出限、定量限、精密度、回收率6個參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

【關(guān)鍵詞】左旋肉堿;脂肪代謝;方法驗(yàn)證;適用性

【中圖分類號】TS252.7 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1674-0688（2021）12-0025-03

左旋肉堿，別名L-肉堿或維生素BT，分子式C7H15NO3，是一種白色晶體或者白色透明粉末，易溶于水、酒精和堿性溶液，200 ℃以上熔化分解。左旋肉堿是由俄國科學(xué)家Gulewitsch和Krimberg在骨骼肌中發(fā)現(xiàn)的。左旋肉堿是參與生物體新陳代謝的重要物質(zhì)，具有多種生理功能。奶粉中的左旋肉堿是促進(jìn)奶粉中的脂肪分解、代謝和供能的重要營養(yǎng)素，同時能促進(jìn)體內(nèi)的脂肪轉(zhuǎn)化為能量，屬于一種類氨基酸類的營養(yǎng)物質(zhì)[1]。人體內(nèi)的左旋肉堿主要來源于羊肉、牛肉、豬肉等紅色肉類，奶粉中適量添加左旋肉堿對人體無害，可以促進(jìn)體內(nèi)脂肪代謝和利用。嬰幼兒飲食結(jié)構(gòu)比較單一，主要飲食來源為各種乳制品，主要的能量來源為乳制品中的脂肪，寶寶體內(nèi)缺乏左旋肉堿，導(dǎo)致脂肪的利用率下降，不利于寶寶體格發(fā)育，添加左旋肉堿可以提高寶寶對奶粉中脂肪的利用率[2]。

本文研究的目的在于通過對方法的線性、線性范圍、檢出限、定量限、精密度、回收率6個指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，證明采用這種檢測方法測定嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的可行性[3]。

1 試驗(yàn)方法——《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測定》（GB 29989—2013）

1.1 原理概述

將樣品中的蛋白質(zhì)用高氯酸溶液沉淀，過濾后的濾液用氫氧化鉀溶液皂化，使左旋肉堿游離。在乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，游離的左旋肉堿和乙酰輔酶A反應(yīng)生成乙酰肉堿和游離的輔酶A。輔酶A和顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，可從工作曲線上查得相應(yīng)的質(zhì)量濃度，據(jù)此計(jì)算樣品中左旋肉堿的含量。

1.2 試驗(yàn)用品

1.2.1 試劑和標(biāo)準(zhǔn)品

13%的高氯酸溶液（HClO4）;4 mol/L的氫氧化鉀溶液（KOH）;10 mol/L的氫氧化鈉溶液（NaOH）;2-硝基苯甲酸;N-2-羥乙基哌嗪-2-乙烷磺酸;乙二胺四乙酸二鈉;乙酰輔酶A（CoA）;乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶（CAT）。其中，乙酰輔酶A（CoA）和乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶（CAT）需要在2～8 ℃的環(huán)境中保存。試驗(yàn)用水均為三級水，所用試劑均為分析純。左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品（C7H15NO3）：純度≥98%。

1.2.2 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

配制濃度為80 g/mL的左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液：將左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品在（102±2）℃的烘箱中烘干2 h后冷卻至室溫，稱取20 mg（精確至0.1 mg）放入小燒杯中，用三級水溶解放入250 mL容量瓶中并定容搖勻。

配制左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、5 mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液放入25 mL的容量瓶中，用三級水定容混勻。注意現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 儀器和設(shè)備

分析天平（型號：AL207-IC）：購于梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，感量為0.1 mg;pH計(jì)（型號：PB-10）：購于賽多利儀器（北京）有限公司，精度為0.01;離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥1 500 r/min;恒溫水浴鍋：溫度可控制在（40±2）℃;分光光度計(jì)（型號：TU-1901）。

1.4 分析過程

1.4.1 樣品預(yù)處理

在小燒杯中稱取5 g（精確至0.1 mg）奶粉樣品，用30 mL、40 ℃的水溶解至100 mL的容量瓶中。高氯酸溶液加10 mL后，上下混合均勻，靜置20 min。用三級水定容后混勻，用定量濾紙過濾至100 mL的三角瓶中。

吸取20 mL濾液于50 mL的小燒杯中，用氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)濾液的pH值，當(dāng)pH值達(dá)到12.5～13.0，放入40 ℃水浴鍋中60 min。經(jīng)冷卻后，用高氯酸調(diào)節(jié)pH達(dá)到7.0～7.5。小心地轉(zhuǎn)入50 mL的容量瓶中，定容混勻，放入4 ℃的冰箱過夜。用時取出放置至室溫后，用注射器吸取上清液用濾膜過濾待用。

1.4.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

在2個1 cm的比色皿中分別吸取2.0 mL的左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別加入0.8 mL的顯色工作液和100μL的CoA溶液混勻，放入分光光度儀中，在412 nm的波長下5 min后進(jìn)行歸零。在外槽的比色皿中加入100μL的CAT溶液混勻，反應(yīng)10 min后比色。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值[4]。

1.4.3 測定樣品

按照步驟“1.4.2”測定處理好的樣液的吸光值，查得樣液濃度。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

樣品中左旋肉堿含量為X，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)mg/100 g表示，按照如下公式計(jì)算：

? ? ?X=×100

上式中：c為查得的樣液濃度，單位為μg/mL;V為濾液體積，單位為mL;m為樣品質(zhì)量，單位為g。

2 方法驗(yàn)證參數(shù)

2.1 線性和線性范圍

左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度為80μg/mL。吸取0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、5 mL的左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液定容到25 mL，經(jīng)過計(jì)算，該系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中左旋肉堿的質(zhì)量濃度分別為1.6μg/mL、3.2μg/mL、6.4μg/mL、9.6μg/mL、16μg/mL。以左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程結(jié)果見表1。

2.2 檢出限和定量限

左旋肉堿的檢出限采用空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法評估，即通過分析大量（n≥10）樣品空白確定檢出限（LOD）。本次實(shí)驗(yàn)通過10次樣品空白獨(dú)立測試，計(jì)算出檢測結(jié)果的算數(shù)平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）確定檢出限（LOD）。計(jì)算公式如下：

LOD=X+3S

上式中：LOD為方法檢出限（mg/100 g）;X為10次獨(dú)立空白平均值;S為10次獨(dú)立空白標(biāo)準(zhǔn)偏差。

定量限（LOQ）的確定主要是從其可信性考慮，為了增加數(shù)據(jù)的可信性，將10倍的檢出限作為本檢驗(yàn)方法的定量限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

當(dāng)樣品稱樣量為5.000 0 g時，該方法的檢出限為0.187 mg/100 g，定量限為1.87 mg/100 g。

2.3 精密度

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行精密度驗(yàn)證，選取1個嬰幼兒配方奶粉樣品進(jìn)行7次重復(fù)性測定，結(jié)果見表3。

結(jié)果表明：經(jīng)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)得到的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.77%，符合（GB/T 27417—2017）的要求。

2.4 回收率

本實(shí)驗(yàn)的回收率驗(yàn)證是通過將已知濃度的分析物加入樣品中，使加標(biāo)后樣品中的左旋肉堿濃度分別處于標(biāo)準(zhǔn)曲線的低、中、高3個濃度，按照預(yù)定的分析方法進(jìn)行檢測，計(jì)算左旋肉堿的回收率[5]，但嬰幼兒配方奶粉中左旋肉堿含量比較高，無法達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)曲線低濃度范圍，故加標(biāo)樣A將已知濃度的分析物加到空白中，加標(biāo)樣B、C加入同一樣品中，其結(jié)果見表4。

3 評價與結(jié)論

3.1 評價

3.1.1 曲線線性范圍評價

本方法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.055 92×C+0.000 73，線性范圍為0～16μg/mL，相關(guān)系數(shù)R為1.000 0，方程擬合度好。符合“對于準(zhǔn)確定量的方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不低于0.99”的規(guī)范要求[6-7]。

3.1.2 檢出限和定量限評價

采用本檢測方法檢測嬰幼兒食品和乳品中的左旋肉堿，當(dāng)稱樣量為5.000 0 g時，檢出限為0.187 mg/100 g，定量限為1.87 mg/100 g，低于國標(biāo)GB 29989—2013中的檢出限，即2 mg/100 g，符合要求[6，8]。

3.1.3 精密度評價

本實(shí)驗(yàn)通過對同一樣品進(jìn)行7次測定，得到重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.77%，符合GB/T 27417—2017的要求。

3.1.4 回收率評價

通過對樣品的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，測得加標(biāo)平均回收率分別為96.4%、94.95%、98.3%。符合GB/T 27417—2017附錄A中方法回收率偏差范圍要求[9]。

3.2 結(jié)論

此次方法驗(yàn)證中，儀器設(shè)備均經(jīng)過檢定并在有效期內(nèi)，檢測方法有效，實(shí)驗(yàn)過程未受到其他干擾，檢測結(jié)果真實(shí)準(zhǔn)確。通過對左旋肉堿方法的驗(yàn)證，各項(xiàng)指標(biāo)均符合實(shí)驗(yàn)需求，故本試驗(yàn)方法能準(zhǔn)確測定嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的含量。

參 考 文 獻(xiàn)

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