還有“永生”的DNA 鏈？（4）

朱欽士 （美國南加州大學醫學院）

（上接2021 年第6 期第7 頁）

2015 年，Sherley 的實驗室用類似的方法（BrdU 和免疫熒光染色），比較小鼠毛囊干細胞分裂時2 個“子”細胞中組蛋白H2A 的1 個變種，H2A.Z 的存在情形，發現在保有永生DNA 鏈的“子”細胞中，H2A.Z 很容易被探測到，但在要分化的細胞中卻探測不到。細胞用鹽酸處理后，在2個細胞中都能探測到H2A.Z，說明在含永生DNA鏈的染色體上，H2A.Z 蛋白是暴露的，而在要分化的細胞中是被屏蔽的。這些結果表明，在干細胞不對稱分裂形成的2 個“子”細胞中，組蛋白H2A.Z的存在狀況是不一樣的。

Sherley 的實驗室還研究小鼠毛囊干細胞分裂時組蛋白H3 的甲基化狀態在“子”細胞中的分布情形。2014 年發表的一篇文章中，他們發現組蛋白H3 第4 位和第27 位的賴氨酸被3 個甲基修飾（分別為H3K4me3 和H3K27me3）的程度在保留干細胞特性的“子”細胞中要高得多，可作為這些干細胞的標志。

2012 年，美國約翰·霍普金斯大學（Johns Hopkins University）Xin Chen 的實驗室用不同顏色的熒光蛋白分別標記果蠅雄性生殖干細胞中“輩分”較高的和新合成的組蛋白H3，再觀察干細胞不對稱分裂后H3 在“子”細胞中的分布情形，發現保留干細胞特性的“子”細胞繼承原組蛋白H3，而新合成的H3 組蛋白則進入要進行分化的“子”細胞。不僅如此，原有的組蛋白H3 第3 位的纈氨酸是被磷酸化的（H3T3ph），而新合成的H3 第3 位的纈氨酸沒有被磷酸化。

這些結果表明，干細胞在進行不對稱分裂時，不僅保留“輩分”大的DNA 鏈，還繼承與其相連的表觀遺傳修飾。這些修飾不僅能使繼承它們的“子”細胞保持干細胞的身份，也為干細胞分裂時染色體的不對稱分配提供依據。

8 表觀遺傳修飾可能是細胞識別DNA年齡的標志

要細胞識別DNA 的年齡，并且以此決定不同年齡的DNA 在“子”細胞中的分配方式，初看起似乎是不可能的事情。以“永生”DNA 鏈為模板合成的DNA 鏈攜帶的信息極為相似，核苷酸序列99.9%以上互補，而且DNA 復制時在新合成鏈上產生的錯誤是隨機的，細胞不可能提前“知道”，也就無法發展出根據這少量序列的差別選擇性地分配DNA 的機制。要更好地理解這個問題，就需要知道細胞分裂時DNA 是如何分配至2 個“子”細胞中的。

在真核生物的細胞分裂時，細胞中的2 個彼此分開的中心粒（centrosome）向對方發出由微管（microtube）組成的細絲，它們的走向類似地球儀上的經線，組成的結構又像一個紡錘，所以又稱為“紡錘體”（spindle）。DNA 復制后，生成的2 份相同的DNA 通過它們的“著絲點”（centromere）彼此連接在一起。著絲點本身也是DNA 的一部分，上面結合許多蛋白質分子。著絲點將DNA 分為“短臂”和“長臂”，通過著絲點連接的2 個染色體就像字母X 的形狀，也就是人們熟悉的染色體的樣子。

在細胞分配染色體時，所有的染色體都運動至紡錘體中部的一個面上。這個面類似于地球的赤道面，所以，被稱為赤道面（equatorial plane）。在赤道面上，通過著絲點連在一起的2 份DNA 各自用其著絲點分別與紡錘體2 端的中心粒發出的微管相連。微管收縮，將2 份DNA“拉”向不同的中心粒，這2 份DNA 就彼此分開，在細胞分裂時進入不同細胞的細胞核，此過程稱為“有絲分裂”（mitosis）。

如果在有絲分裂過程中分開的只是DNA，細胞是無法分辨2 份DNA 的年齡的，因為它們之間的核苷酸序列幾乎完全相同。但DNA 并不是裸露的，而是與組蛋白組成染色質，在細胞分裂時形成染色體。如果與不同年齡DNA 結合的組蛋白修飾狀況不同，細胞就可根據這些差別判斷DNA 的年齡，不對稱分配就變得可能。

模板DNA 和新合成的DNA 就像雙胞胎兄弟，穿同樣的衣服，彼此之間的差別就極小，幾乎無法辨別。但如果在雙胞胎兄弟穿的衣服上作出改變，例如，配戴上不同的徽章，就容易區分彼此。組蛋白的修飾，例如，前文談到的組蛋白的乙?；?、甲基化、和磷酸化，就相當于在衣服上佩戴各種徽章，細胞即可識別它們。

要選擇性地分配DNA（染色體），只有染色體之間的差別還不夠，紡錘體中的2 個中心粒也需要有區別，這樣“輩分”高的DNA 才“知道”與哪個中心粒相連，從而進入特定的“子”細胞。實際的情形也的確如此：細胞分裂時，每個“子”細胞只接收1 個中心粒，在下一次細胞分裂前，這個中心粒進行復制，形成2 個中心粒，所以，2 個中心粒的“輩分”不同，類似于模板DNA 鏈和新合成DNA 鏈的“輩分”。這2 個“輩分”不同的中心粒所結合蛋白質（例如，Ninein 和Cenexin）的情形也不同，這樣不同的中心粒就可與不同輩分的染色體相互識別，進而通過微管相連，不同年齡的DNA就可有選擇性地進入命運不同的“子”細胞。

9 細胞進行對稱分裂和不對稱分裂的控制機制

在動物體內，細胞的不對稱分裂和DNA 的選擇性分配只是干細胞特有的功能，一旦成為體細胞的前體細胞，再繁殖分化成為體細胞，這個功能就消失了，細胞改而進行對稱分裂。其中一定有控制機制，決定細胞的分裂是否對稱。

在胚胎發育過程中，一個受精卵細胞要形成由數量極其龐大的細胞組成的生物體，在開始階段也是進行對稱分裂，以增加干細胞的數量。例如，從受精卵（可看成是全能干細胞）形成囊胚期的內細胞團中，每一個細胞都是胚胎干細胞，在適當的條件下都可發育成為一個完整的生物體，這些內細胞團的細胞也是通過對稱分裂形成的。只有身體逐漸發育成熟，在每種組織中形成成體干細胞后，才開始不對稱分裂，以補充不斷消耗的體細胞。從發育期干細胞的對稱分裂轉變為不對稱分裂，其中也一定有一個轉換機制。

而且即使是成體干細胞也不總是進行不對稱分裂。不對稱分裂只是在需要干細胞補充體細胞時才發生。干細胞除不對稱分裂，也進行對稱分裂，分裂形成的2 個“子”細胞都是干細胞，以彌補由各種原因引起的干細胞數量的下降。這也一定有一個控制機制。

然而，要研究這個機制很難，細胞進行有絲分裂的過程極為復雜，控制因素非常多。要從中找出啟動非對稱分裂的因素，目前還是一個難以實現的目標，但是近年的科學研究已提供一些有趣的線索，表明細胞的不對稱分裂與以下因素有關。

9.1 DNA 的甲基化 在上一節中，筆者談到“永生”DNA 鏈含有較多的羥甲基化的胞嘧啶。2013年，美國加州大學伯克利分校（UC Berkeley）Michael Conboy 的實驗室表明，小鼠胚胎干細胞的不對稱分裂需要DNA 的甲基化。如果敲除甲基化酶Dnmt3（DNA methyltransferase-3），這些細胞就不再進行不對稱分裂。

DNA 的甲基化狀況與組蛋白的修飾密切相關，因此，這個結果無法區分細胞在不對稱分裂的過程中，依靠的是DNA 的甲基化狀況，還是組蛋白的修飾狀況。

9.2 蛋白p53 成體干細胞在體外培養時非常難以擴張，因為其總是進行不對稱分裂。每個干細胞分裂時只產生一個干細胞，另一個是要進行分化的體細胞的前體細胞。前體細胞繁殖分化，形成大量的體細胞。這樣，干細胞的數量并不會隨著細胞分裂而不斷增加，其濃度反而會隨著培養時間延長體細胞的大量形成而不斷被稀釋，最后喪失干細胞系。

美國波士頓生物醫學研究所的James Sherley發現，如果在干細胞中讓蛋白p53 恢復表達，干細胞就會進行對稱分裂，形成的后代細胞也都是干細胞，這就解決了在體外增殖成體干細胞的問題。

p53 是一種抗腫瘤蛋白，在DNA 被損傷至一定程度時會阻止細胞進行分裂，防止這些細胞繁殖為癌細胞。p53 的一個信號傳遞鏈就是抑制磷酸次黃嘌呤脫氫酶（IMPDH）的活性，阻止它將黃嘌呤核苷（xanthosine）代謝掉。因此，在干細胞培養液中直接加入黃嘌呤核苷也能讓干細胞從不對稱分裂變為對稱分裂，達到干細胞增殖的目的。

9.3 蛋白激酶Pim-1 Pim-1 是一個蛋白激酶，能在其他蛋白質分子的絲氨酸和蘇氨酸殘基的側鏈上加上磷酸根。在細胞進行有絲分裂時，Pim-1 位于紡錘體的兩極，磷酸化與微管結合的蛋白NuMA，還與若干與有絲分裂有關的蛋白質相互作用，包括與著絲點結合的蛋白HP-1（hetero‐chromatin protein 1）、給有絲分裂提供動力的動力蛋白dynein、動力蛋白激活蛋白dynactin 等，因此，是與DNA 的分配過程有密切關系的酶。2012 年，美國圣迭哥州立大學（San Diego State University）Mark Sussman 的實驗室用BrdU 標記DNA 鏈的方法檢測心肌干細胞進行不對稱分裂的狀況，發現增加Pim-1 的量能使不對稱分裂的幾率加倍，表明Pim-1 在干細胞保留“永生”DNA 鏈的過程中起重要作用。

9.4 組蛋白H3 上纈氨酸的磷酸化 2015 年，前面提到過的美國約翰·霍普金斯大學Xin Chen 的實驗室還表明，在雄性果蠅的生殖干細胞的分裂中，組蛋白H3 上纈氨酸的磷酸化狀態與細胞是否進行不對稱分裂有直接關系。在H3 第3 位的纈氨酸被磷酸化時（H3T3ph），干細胞進行不對稱分裂，帶有H3T3ph 修飾的組蛋白H3 與“輩分”高的DNA 在一起。如果將第3 位的纈氨酸變為不能被磷酸化的丙氨酸（H3T3A），細胞就從不對稱分裂變為對稱分裂。該結果被發表于《細胞》（Cell）雜志上，是組蛋白的修飾狀況與干細胞分裂方式直接相關的證明。

9.5 Wnt 信號鏈 2011 年，加拿大多倫多大學（University of Toronto）Cindi Morshead 的實驗室報道，在進行不對稱分裂的小鼠神經干細胞中，Wnt信號傳遞鏈的活性被抑制，而在進行對稱分裂的神經干細胞中，Wnt 信號傳遞鏈活躍。Wnt 是果蠅的翅膀缺失基因wg（wingless）和小鼠致癌基因intl（integration 1）2 個名稱的混合，因為在不同動物中發現的這2 個基因實際上是同一個基因，從線蟲、果蠅、小鼠到人中都高度保守，在動物胚胎發育和器官形成上起重要作用。在成體動物中，Wnt 信號看來是和保持干細胞增殖的特性（即通過對稱分裂增加干細胞的數量）有關，而在干細胞進行不對稱分裂時，Wnt 信號鏈必須被關掉。

9.6 左-右不對稱蛋白Lrd 最有趣的是干細胞的不對稱分裂居然與決定小鼠內臟左-右不對稱的蛋白Lrd（left-right dynein）有關。敲除小鼠的lrd基因，小鼠內臟位置左右不對稱（類似人的心臟在左邊，肝臟在右邊）的情形就被打亂，變成隨機的。前面談到的美國國立癌癥研究所的Amar Klar 發現，降低小鼠胚胎干細胞中lrd信使RNA（mRNA）的濃度，干細胞就不再進行不對稱分裂，也不再保留永生的DNA。

目前，得到的研究結果還是零星的，彼此之間也沒有關系。這就像一張復雜的拼圖，只有少數幾片，還彼此不相連，然而這些結果已顯示，干細胞的不對稱分裂和保留“永生”DNA 鏈的過程是非常復雜的，要了解它還需要大量的研究工作，但目前對機制還認識不足的狀況并不影響理解“永生”的DNA 鏈存在的事實。

“永生”的DNA 鏈，其實還和“永生”的生殖細胞一脈相承。

10 “永生”的DNA 鏈和永生的生殖細胞

在干細胞中“永生”的DNA 鏈出現之前，所有的生物就已發展出永生的生殖細胞。生物的物種要延續，必須要有將生命傳給后代的生殖細胞，而且由生殖細胞繁殖出的后代的壽命不會由于繁殖代數的增加而減少，否則物種就會凋亡?，F在身體上的每一個細胞，都是幾十億年前那個單細胞“祖宗”連續不斷分裂的后代。從此意義上講，生殖細胞真的是“永生”的。

與此相反，組成生物身體的細胞，即體細胞，都是有壽命的。無論體細胞有多少防御和修復機制，都終將死亡。由體細胞組成的生物體也都有壽命，而且許多體細胞的壽命比生物體總的壽命要短。

但生殖細胞和體細胞含有完全相同的DNA，生殖細胞所含有的基因，體細胞都具有，為什么體細胞必然死亡，而生殖細胞卻能永生？答案是：生殖細胞具有與體細胞不同的表觀遺傳修飾。要更詳細地了解這個問題，可參見筆者的另一篇文章《為什么生殖細胞能永生？》，發表于2014 年5 月10 日《科學網》的博客，或《生物學通報》2014 年第5 期中的文章。

干細胞是隨著多細胞生物的出現而發展的，它們在身體發育完成后，執行替補體細胞的任務，完成這個任務的過程和由生殖細胞發展出體細胞相似，因此，可看作是生殖細胞在身體各個組織中的延伸或“派出部隊”。干細胞和生殖細胞都是分化程度很低的細胞，都有保持其“真身”的任務，而且都是通過表觀遺傳修飾完成的。

干細胞數量不多，要在替補體細胞的同時保留自己，就要進行不對稱分裂，其中的一個“子”細胞要繼承其干細胞的身份和任務。因此，在干細胞分裂時，作為干細胞后代的“子”細胞不僅要繼承干細胞的DNA，還必需繼承維持干細胞特性的表觀遺傳修飾，而這些表觀遺傳修飾是和干細胞中年齡較大的DNA 聯系在一起的，這就是干細胞分裂時要選擇性地保留“爺爺”輩DNA 的主要原因。干細胞在保留原有表觀遺傳修飾的同時，也就保留與這些表觀遺傳修飾相連的，DNA 鏈的“原件”，這樣既能保持干細胞的“真身”，又能大幅減少DNA 鏈通過復制過程導致的序列變化，降低癌細胞發生的可能性。由此，不得不佩服生物的“聰明”，生物演化的創造力也遠超出想象。

然而，將干細胞所保留的DNA 鏈說成是“永生”的，則只有相對的意義。干細胞畢竟不是生殖細胞，而是會隨著生物體的死亡而死亡的，里面的DNA 鏈也就不可能“永生”。干細胞除進行不對稱分裂，還會進行對稱分裂，對稱分裂時DNA 復制造成的錯誤也會保留在后代的干細胞中。如果含有“原始文件”的干細胞由于某種原因死亡，而繼承帶有復制錯誤的DNA 鏈的干細胞后代存活下，也可導致“原始文件”的毀滅。因此，在本文中，可給“永生”二字加上引號。但若考慮到Cairns 提出“永生DNA 鏈”的概念時，只限于干細胞，而沒有考慮到干細胞還進行對稱分裂的情況，就可理解他將干細胞保留的DNA 鏈稱為是“永生”的。因為在干細胞壽命的范圍內，被干細胞保留的DNA 鏈還真的可以是“永生”的。