氣相色譜-質譜聯用法測定食品中9種膽固醇氧化物

楊俊，吳軒民，侯璐，張協光，李忠，盧燦鑫

1. 深圳市計量質量檢測研究院，國家營養食品質量監督檢驗中心（廣東）（深圳 518109）；2. 南京醫科大學公共衛生學院（南京 211166）

膽固醇氧化物（Cholesterol Oxidation Products，COPs）是膽固醇的氧化產物，普遍存在于肉制品、乳制品、蛋制品和動物脂肪中[1]。在食品制作工藝流程和處理過程中，膽固醇通過光、氧及高溫等作用容易發生自身氧化反應，進而衍生成膽固醇氧化產物[2]。膽固醇氧化物對健康存在一定損害，醫學研究已指出膽固醇氧化物與人體動脈硬化[3]、基因突變[4]以及致癌[5]有直接關系。

目前，膽固醇氧化物的檢測方法有氣相色譜法[6]、高效液相色譜法[7]、液相色譜-質譜聯用法[8]以及氣相色譜-質譜聯用法[9]等。氣相色譜-質譜聯用法結合了氣相色譜和質譜的優點，其利用毛細管柱和單重四極桿檢測器，可以克服基質干擾，有更好的分辨率、更高的靈敏度，具有很強的定性定量能力[10]。

此次試驗依據傳統Folch提取法[11]，并作了一定改進；探討了固相萃取柱對試驗結果的影響，優化了氣相色譜-質譜聯用儀的分離條件。同時，為了避免提取過程中可能會出現待測物的損失，影響試驗結果，選擇19-羥基膽固醇作為試驗的內標物[12]，以提高試驗結果的準確性。以市面上的常見動物源性的食品如魚肉、豬肉和牛肉為研究對象，對其COPs含量進行檢測。分析新鮮肉制品和腌制處理過的肉制品中9種膽固醇氧化物含量差異情況，為食品中膽固醇氧化物檢測的提供了技術支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

7890B-5977B氣相質譜儀（美國Agilent公司）；全自動氮吹儀（上海安譜 EFAA-DC24）；超聲儀（予皓 YH-200DH）；Milli-Q Reference超純水系統（法國 Millipore）；電子天平（萬分之一，中國賽多利斯）；旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司）；SPE硅膠柱/氨基柱（500 mg/3 mL，美國Supelco公司）。

5β，6β-環氧化膽固醇（99%）、7α-羥基膽固醇（98%）、20α-羥基膽固醇（97%）、7β-羥基膽固醇（96.7%）、5α，6α-環膽固醇氧化物（92%）、3β，5α，6β-膽甾烷三醇（97%）、25-羥基膽固醇（98%）、7-酮基膽固醇（98%）、27-羥基膽固醇（97%）、19-羥基膽固醇（98%）：TRC公司；N, O-雙（三甲基硅烷）三氟乙酞胺（BSTFA，含1%三甲基氯硅烷，Sigma-Aldrich公司）；三氯甲烷、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、乙醚、丙酮（色譜純，Merck公司）；實驗室用水（超純水）。試驗中的魚肉、豬肉和牛肉等樣品（市售）。

1.2 試驗方法

1.2.1 氣相色譜條件

色譜柱，DB-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫升溫程序，初始溫度150 ℃（保持2 min）→20℃/min升溫至300 ℃（保持20 min）；進樣口溫度，280 ℃；進樣模式，不分流；進樣量，1.0 μL；載氣，氦氣（He，純度＞99.999%）。

1.2.2 質譜條件

離子源溫度，230 ℃；四極桿溫度，150 ℃；傳輸線溫度，250 ℃；電離方式，電子轟擊（EI）離子源；電子能量，70 eV；電子倍增器電壓，1 632 V；采集模式，離子掃描模式（SIM）；掃描質量范圍，m/z50～550；溶劑延遲，8 min。

1.2.3 標準溶液配制

分別稱取0.005 0 g 10種膽固醇氧化物標準品，使用色譜純的正己烷定容至5.00 mL，超聲混合均勻，配制質量濃度為1.0 mg/mL的膽固醇氧化物標準品的儲備液。用正己烷逐級稀釋標準品儲備液，得到0.2，0.5，1.0，5.0和10.0 μg/mL混合標準品工作液，并且使得系列工作液中19-羥基膽固醇內標物的質量濃度均為0.2 μg/mL，放置于棕色瓶中。于4 ℃避光保存，保存期為1個月。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品脂類提取

準確稱取2.0 g均質粉碎的樣品于三角瓶中，加入2 μg 19-羥基膽固醇作為內標物。加入150 mL三氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）提取劑，充分振蕩2 min，然后超聲30 min；置于4 ℃環境中過夜，靜置分層，再用濾紙過濾，獲得濾液，氮氣吹干，得到脂類物質。

1.3.2 皂化

向1.3.1小節中得到的脂類提取物中加入10 mL 1 mol/L KOH溶液和10 mL甲醇，充分振蕩，超聲5 min，使樣品混合。室溫下靜置皂化10 h，然后用10 mL去離子水轉移至分液漏斗中，用10 mL乙酸乙酯重復萃取3次。移取上層溶液，再用10 mL去離子水沖洗萃取液。用無水硫酸鈉過濾除水，獲得濾液，在旋轉蒸發儀上濃縮至近干。

1.3.3 凈化濃縮

向1.3.2小節中得到的皂化后的提取物中加入3 mL正己烷，充分振蕩溶解，然后緩慢加入到已活化的NH2-SPE中，依次用10 mL正己烷-乙酸乙酯（95∶5，V/V）、10 mL正己烷-乙酸乙酯（90∶10，V/V）洗柱，棄掉廢液，最后用5 mL丙酮洗柱，收集濾液，氮氣吹干。

1.3.4 衍生化

加入100 μL N, O-雙（三甲基硅烷）三氟乙酰胺BSTFA衍生試劑，在60 ℃下衍生40 min，衍生結束后，用氮氣吹干，用1.0 mL正己烷溶解，上機測試。

2 結果與分析

2.1 固相萃取柱的選擇

固相萃取是利用柱填料對不同極性物質的選擇性吸附與選擇性洗脫，從而實現樣品的凈化和濃縮。在提取的脂質中，膽固醇脂類和三油甘脂極性最弱，磷脂類極性最強，而膽固醇和膽固醇氧化物具有中等極性[13]。因此，可以選擇極性的固相萃取柱，再用不同組分的極性溶劑洗脫，從而實現凈化和濃縮COPs。

此次試驗選取2種常見的固相萃取柱（NH2-SPE和Si-SPE），先用5 mL正己烷活化，加入樣品后，按照圖1的洗脫步驟，探討不同固相萃取柱對試驗結果的影響。結果表明，使用NH2-SPE具有更高的回收率（見圖2），因此試驗選擇NH2-SPE進行凈化濃縮操作。

圖1 不同SPE洗脫步驟示意圖

圖2 不同SPE類型的影響

2.2 色譜分離條件的優化

考慮到COPs結構相近，具有中等極性，試驗選擇非極性柱DB-5ms毛細管色譜柱，并對10種COPs的色譜分離條件進行優化。最終確定的柱溫箱升溫程序為：初始柱溫箱溫度150 ℃（保持2 min）→20 ℃/min升溫至300 ℃（保持20 min）。按照柱溫箱的優化條件，確定質譜端選擇電子轟擊離子源，能量設置為70 eV，電子倍增器電壓設置為1 632 V；采集模式為SIM模式，掃描質量范圍為m/z50～550。氣相色譜-質譜總離子流圖如圖3所示，在最佳的色譜分離條件下，10種COPs在24 min內能實現基線分離，分離效果良好；并且19-羥基膽固醇保留時間為16.8 min，位于保留時間中前段，與其他9種COPs沒有干擾，結果表明19-羥基膽固醇可以作為此次試驗的內標物。

2.3 方法學評價

2.3.1 標準曲線與檢出限

取膽固醇氧化物系列混合標準品工作液，按1.3.4小節進行衍生化反應，利用已建立的色譜分離條件，進行測定分析。以9種COPs的定量離子峰面積與19-羥基膽固醇的定量離子峰面積的比值作Y軸，以9種COPs工作液濃度與19-羥基膽固醇濃度的比值作X軸，繪制標準曲線，進行線性回歸，計算即可得到9種膽固醇氧化物的含量。如表1所示，在0.2～10 μg/mL線性范圍內，9種COPs的相關系數均大于0.998，方法檢出限低于0.000 15 mg/kg。

2.3.2 回收率和精密度

選取新鮮魚肉、豬肉和牛肉等樣品，分別均質粉碎，作為空白樣品。添加高、中、低3個水平濃度的COPs系列混合標準品工作液，按照1.3小節處理，進行加標回收率測定，每個加標水平平行測定3次（n=3）。如表2所示，9種COPs的加標回收率在79.6%～101%之間，其相對標準偏差（RSD）低于5%，表明該方法滿足魚肉、豬肉和牛肉等樣品中9種COPs含量的分析檢測。

圖3 10種COPs混合標準溶液（0.2 μg/mL）的氣相色譜-質譜總離子流色譜圖

表1 9種COPs的檢出限、線性范圍、回歸方程和相關系數（R2）

表2 空白樣品中9種COPs的回收率和精密度（n=3）

接表2

2.3.3 實際樣品的檢測

從市場上選取新鮮魚肉、新鮮豬肉、新鮮牛肉、腌制魚肉、腌制豬肉、腌制牛肉作為試驗樣品，利用所建立的分析方法檢測COPs含量，每個樣品平行測定兩次，取平均值，結果如表3所示。新鮮魚肉、豬肉和牛肉中COPs總量為未檢出，而腌制魚肉中COPs總量為4.55 mg/kg；腌制豬肉中COPs總量為5.91 mg/kg；腌制牛肉中COPs總量為6.43 mg/kg。腌制過的肉類食品中COPs含量顯著高于新鮮的同類食品，這表明在食品腌制處理過程中，膽固醇氧化產物在光、氧等作用下反應產生。

表3 肉類樣品中9種COPs的含量（n=2）

3 結論

此次試驗建立了氣相色譜-質譜測定食品中9種COPs含量的檢測方法。采用19-羥基膽固醇作為內標物，以提高檢測方法的準確性。改進了前處理方法，優化了皂化條件、固相萃取柱以及氣相色譜/質譜聯用儀的分離條件，該方法的線性范圍、檢出限、回收率和精密度均能夠滿足實際樣品的檢測要求。通過對市售食品中COPs的測定，結果發現腌制過的肉類食品中COPs含量顯著高于新鮮的同類食品。此次試驗為食品中膽固醇氧化物的檢測提供技術支持。