紅樹莓發(fā)酵果酒及其抗氧化活性

宮祥博 ，延海瑩，田迎櫻，王順濤，王百川，王鵬*

1. 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（青島 266003）；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院（煙臺(tái) 264000）；3. 煙臺(tái)欣和企業(yè)食品有限公司（煙臺(tái) 264006）

紅樹莓（Rubus idaeusL.）又名覆盆子、托盤、馬林等，屬薔薇科懸鉤子屬，廣泛分布于溫帶地區(qū)。其果實(shí)多汁、酸甜可口，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，被譽(yù)為“黃金水果”[1-2]。相關(guān)研究表明，紅樹莓中含有優(yōu)質(zhì)的黃酮類、酚酸類和萜類等生理活性物質(zhì)，能夠有效清除機(jī)體中的自由基，緩解細(xì)胞組織過氧化損傷，具有良好食用和藥用價(jià)值[3-4]。

果酒通常指以水果為主要原料釀造的飲料，酒精度較低，一般在10%～12%vol，在具備酒香特質(zhì)的同時(shí)，保留水果中的特色成分，較于傳統(tǒng)蒸餾酒品具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。隨著生物技術(shù)的日新月異，多種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的水果得到開發(fā)利用，藍(lán)莓果酒[5]、柑橘果酒[6]、桑葚果酒[7]等產(chǎn)品逐漸進(jìn)入日常生活。樹莓作為新興的第三代小漿果，含有豐富酚類小分子功能成分，逐漸成為果酒開發(fā)的優(yōu)質(zhì)潛在原料之一。

因此，以成熟期紅樹莓為主要原料，建立樹莓果酒的發(fā)酵工藝。對(duì)發(fā)酵過程中的特征性功能黃酮類因子進(jìn)行定量測(cè)定，通過體外抗氧化和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用進(jìn)行發(fā)酵效果的評(píng)估，以期確定最優(yōu)發(fā)酵工藝和紅樹莓果酒的陳釀狀態(tài)，為紅樹莓的加工利用及高值化產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

紅樹莓（煙臺(tái)康世緣樹莓合作社種植基地）；71B降酸型酵母（法國(guó)LAFFORT公司）；RV171型酵母（安琪酵母股份有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；多種抗氧化酶檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；葡萄糖、乙醇、蘆丁等（均為國(guó)產(chǎn)分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；UV-6000PC紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；DL-CJ-1N型超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；BJ5060UV型CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司）；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅樹莓果酒制備工藝流程

紅樹莓→預(yù)處理→酶解→榨汁→成分調(diào)配→接種果酒酵母→主發(fā)酵→倒灌、陳釀→下膠、澄清→二次倒灌→過濾→灌裝→殺菌→產(chǎn)品

1.3.2 發(fā)酵工藝及組別設(shè)置

以調(diào)節(jié)糖度的紅樹莓果汁為主要發(fā)酵原料，輔以菌株生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)元素；將活化的酵母菌按體積分?jǐn)?shù)5%接種量無菌接入發(fā)酵罐中發(fā)酵。在主發(fā)酵工藝設(shè)置方面，根據(jù)2種不同果酒酵母和3個(gè)適宜發(fā)酵溫度區(qū)間設(shè)置6組主發(fā)酵工藝，依次為1號(hào)（71B酵母，發(fā)酵溫度24～28 ℃）、2號(hào)（71B酵母，發(fā)酵溫度20～24℃）、3號(hào)（71B酵母，發(fā)酵溫度15～20 ℃）、4號(hào)（RV171酵母，發(fā)酵溫度24～28 ℃）、5號(hào)（RV171酵母，發(fā)酵溫度24～28 ℃）、6號(hào)（RV171酵母，發(fā)酵溫度15～20 ℃）。

1.3.3 理化指標(biāo)的測(cè)定

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對(duì)紅樹莓果酒樣品的酒精度、總糖含量和總酸含量進(jìn)行測(cè)定[8]。

1.3.4 花色苷含量測(cè)定

采用pH比色示差法測(cè)定總花色苷的含量[9]。取2 mL待測(cè)樣品液，分別加入pH 1.0和pH 4.5緩沖液，定容至20 mL，振蕩混勻之后于4 ℃靜置2 h。分別于510 nm波長(zhǎng)和700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定記錄吸光度。花色苷含量的計(jì)算方法如式（1）和（2）所示。

式中：A為吸光度；V為提取液總體積，mL；m為取樣品質(zhì)量，g；26 900為矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)；449.2為矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾質(zhì)量。

1.3.5 總黃酮含量測(cè)定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉的方法測(cè)定總黃酮的含量[10]。以參考文獻(xiàn)方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在樣品測(cè)定方面，取適量待測(cè)液，加入30%乙醇補(bǔ)充至5.0 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液混合均勻，靜置6 min后，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，繼續(xù)靜置6 min后，加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液及0.4 mL超純水，搖勻后靜置15 min，于510 nm處測(cè)吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮含量。

1.3.6 體外抗氧化評(píng)價(jià)

使用Fenton反應(yīng)體系測(cè)定·OH清除能力[11]。反應(yīng)體系包括1 mL水楊酸-乙醇溶液、FeSO4溶液和不同濃度的樣品液，加入1 mL的H2O2開始反應(yīng)，在37 ℃保溫30 min后，在510 nm處測(cè)定吸光度A1。考慮到多糖本身的吸光度，以蒸餾水代替H2O2，測(cè)定多糖的本底吸光度A2。按文獻(xiàn)[11]方法計(jì)算·OH清除率。

1.3.7 HUVEC氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

HUVEC損傷細(xì)胞存活率測(cè)定，使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，分別加入不同的果酒凍干粉，質(zhì)量濃度梯度為25，50，200和400 μg/mL，設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，每孔加樣200 μL。孵育24 h之后，將培養(yǎng)基吸出，每孔加入300 μmol/L叔丁基過氧化氫（t-BHP）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、模型組（只添加t-BHP）和紅樹莓果酒凍干粉組作為對(duì)照。使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

細(xì)胞抗氧化酶的測(cè)定參照南京建成生物工程研究所購買的抗氧化酶檢測(cè)試劑盒的操作方法，分別對(duì)乳酸脫氫酶（LDH）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）的含量進(jìn)行測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel軟件和SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理，每組試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果和討論

2.1 紅樹莓發(fā)酵果酒指標(biāo)檢測(cè)

2.1.1 酒精度測(cè)定

在發(fā)酵過程中，酵母菌可將紅樹莓中的天然糖類成分轉(zhuǎn)化為乙醇，并累積于果酒中，使得果酒具有一定酒精度。酒精度不僅能夠反映酒品中酒精的產(chǎn)生情況，也是體現(xiàn)果酒發(fā)酵進(jìn)程的重要指標(biāo)[6]。在紅樹莓果酒的發(fā)酵過程中，6種不同發(fā)酵條件酒精度如表1所示。在起始糖濃度相同的條件下，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)刻的酒精度均在12.0%vol左右。

表1 6種樣品的酒精度分析

2.1.2 發(fā)酵果酒樣品營(yíng)養(yǎng)成分分析

發(fā)酵前后不同工藝制備的紅樹莓果酒營(yíng)養(yǎng)成分解析結(jié)果如表2所示。發(fā)酵后期總糖濃度顯著下降，主要因?yàn)槠渥鳛榻湍妇L(zhǎng)的碳源被分解利用。花色苷在發(fā)酵前后含量變化不顯著。發(fā)酵后期總黃酮濃度顯著升高，表明菌體在生長(zhǎng)過程中，將大分子物質(zhì)分解為黃酮類小分子物質(zhì)。對(duì)比不同發(fā)酵工藝制備的果酒樣品可知，4號(hào)樣品中總酸濃度較低，特征性營(yíng)養(yǎng)成分花色苷和總黃酮濃度分別為11.49和49.78 mg/100 mL，均高于其他果酒樣品，效果最佳。

表2 不同樣品的營(yíng)養(yǎng)組分分析

2.2 紅樹莓果酒體外抗氧化評(píng)價(jià)

2.2.1 羥自由基（·OH）清除

圖1 不同樣品的自由基清除能力

羥自由基可通過電子轉(zhuǎn)移、脫氫或者加成的方法同體內(nèi)的多種分子進(jìn)行作用，從而造成人體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的氧化，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞突變或者壞死[13]。不同紅樹莓果酒對(duì)體外羥自由基的清除效果如圖1（A）所示。結(jié)果表明，發(fā)酵后樣品較于原料樹莓汁·OH清除效果較好。4號(hào)樣品清除效果最優(yōu)，主要是由于其中含有較高的花色苷、黃酮類抗氧化物質(zhì)[14]。

超氧陰離子是由酶系統(tǒng)自氧化與無酶系統(tǒng)電子轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的，通常與羥基進(jìn)行結(jié)合，產(chǎn)物對(duì)機(jī)體DNA有損傷效果，從而破壞機(jī)體功能[4]。如圖1（B）所示，不同發(fā)酵條件的紅樹莓果酒對(duì)超氧自由基的清除效果也不盡相同。與羥自由基清除效果相似，發(fā)酵后樣品的超氧自由基清除效果顯著提高，且4號(hào)樣品清除效果最佳，即采用RV171酵母發(fā)酵，溫區(qū)24～28 ℃發(fā)酵制備的果酒樣品，超氧自由基清除效果可達(dá)61.09%。

2.3 紅樹莓果酒對(duì)HUVEC氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)效果評(píng)價(jià)

2.3.1 細(xì)胞損傷修復(fù)效果評(píng)價(jià)

在細(xì)胞水平試驗(yàn)方面，建立t-BHP損傷的HUVEC模型，并進(jìn)行4號(hào)樣品濃度梯度探究。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，通過空白對(duì)照組與模型組對(duì)比，t-BHP處理后HUVEC細(xì)胞存活率降為63.57%（p＜0.01），表明t-BHP造成顯著細(xì)胞氧化損傷。通過模型組與試驗(yàn)組對(duì)比，受試物可以顯著提高細(xì)胞存活率。發(fā)酵9 d組的細(xì)胞存活率效果最好，且相較模型組均顯著提高，表明隨著發(fā)酵進(jìn)程進(jìn)行，紅樹莓果酒發(fā)酵液可有效改善HUVEC被t-BHP造成的氧化損傷。

圖2 不同發(fā)酵天數(shù)紅樹莓果酒凍干粉對(duì)t-BHP導(dǎo)致的HUVEC細(xì)胞存活率的影響

2.3.2 對(duì)LDH的影響評(píng)價(jià)

細(xì)胞受到氧化損傷或死亡時(shí)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，LDH會(huì)被大量釋放到上清培養(yǎng)液中，所以測(cè)定上清中LDH水平可以一定程度反映細(xì)胞損傷程度[14]。試驗(yàn)結(jié)果如圖3（A）所示，通過正常組與模型組對(duì)比，經(jīng)t-BHP處理細(xì)胞后，上清液中的LDH釋放量增加401.39%（p＜0.01），表明t-BHP造成細(xì)胞膜破壞。發(fā)酵1，5和9 d的紅樹莓果酒樣品均能顯著降低上清液中的LDH釋放量，發(fā)酵9 d果酒樣品效果最佳。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，紅樹莓果酒對(duì)細(xì)胞具有更好的氧化應(yīng)激保護(hù)作用，能夠保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及完整性。

圖3 紅樹莓果酒凍干粉對(duì)t-BHP導(dǎo)致的HUVEC氧化損傷保護(hù)作用

2.3.3 對(duì)GSH-PX的影響評(píng)價(jià)

GSH-PX是機(jī)體中廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，是研究細(xì)胞抗氧化能力的一種重要指標(biāo)[15]。不同發(fā)酵時(shí)間紅樹莓果酒對(duì)GSH-PX的影響效果如圖3（B）所示，通過模型組與正常組對(duì)比，t-BHP導(dǎo)致GSH-PX降低44.06%（p＜0.01），表明模型組構(gòu)建成功。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)GSH-PX濃度逐漸提高，發(fā)酵9 d的紅樹莓果酒樣品處理的細(xì)胞，其GSHPX濃度與正常組濃度相似，表明紅樹莓果酒有利于細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)恢復(fù)。

3 結(jié)論

在試驗(yàn)過程中，以紅樹莓為主要原料進(jìn)行發(fā)酵果酒的制備，建立最優(yōu)發(fā)酵工藝，通過體外自由基清除試驗(yàn)與細(xì)胞損傷保護(hù)試驗(yàn)進(jìn)行果酒抗氧化效果評(píng)價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)，RV171型酵母在24～28 ℃控溫條件下，發(fā)酵效果良好，且在羥自由基（·OH）和超氧自由基（O2-·）清除試驗(yàn)中效果顯著。最適條件下發(fā)酵9 d的果酒樣品具有更好的細(xì)胞損傷保護(hù)效果，與模型組相比，試驗(yàn)組能顯著降低細(xì)胞上清液中LDH含量，并顯著升高GSH-PX含量，說明紅樹莓發(fā)酵果酒具有良好抗氧化效果。與此同時(shí)，也為紅樹莓相關(guān)功能性健康食品的研發(fā)提供借鑒。