茶皂素的提取及其熱穩定性分析

譚登峰，龐錦英，胡華林，孫超

1. 貴州醫科大學，省部共建藥物植物功效與利用國家重點實驗室/貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室（貴陽 550014）；2. 南寧師范大學化學與材料科學學院（南寧 530001）

茶皂素（Tea saponin）是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）植物皂素的統稱[1]，是一類三萜類皂苷混合物[2]，由疏水性的配基、親水性的糖體和有機酸組成[3-4]。茶皂素具有性溫和、可降解、無毒害等特點，是一種生物活性能和表面活性能優異的生物質原料，市場價格較高，純度60%的茶皂素售價達5 000萬元/t，在醫藥、洗滌、紡織、阻燃等領域應用廣泛[5-9]。

茶皂素的提取方法主要分為水浸法和有機溶劑法以及在此基礎上衍生的微波或超聲波輔助提取法[10-11]，其工藝大多以茶皂素提取率或純度中的一種為優化對象，同時考慮以提取率及純度為優化對象的研究較少，并且多數醇提或水提后便直接濃縮，缺少后續的純化步驟，造成提取率及純度都不高。因此，有必要對茶皂素的提取工藝做進一步深入研究。

熱重分析儀（TGA）是利用熱重法來檢測物質質量隨溫度變化的一種儀器，被廣泛運用于天然產物及其改性物的熱穩定性研究[12-14]。茶皂素的研究主要集中在提取、分離、生物活性等方面，而對其材料本身的表征研究較少，特別是在茶皂素的熱穩定性方面。鑒于此，試驗同時考慮以提取率及純度為優化對象，采用Box-Behnken試驗設計法從廉價的油茶餅粕中提取高純度的天然茶皂素，確定最優提取工藝，進而利用熱重分析儀來分析不同純度的茶皂素熱穩定性能，以期為油茶餅粕中茶皂素的提取及其在表面活性劑領域中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

油茶餅粕（茶枯，貴州石阡佛頂山野生油茶油業有限公司）；石油醚、無水乙醇、丙酮、明礬、氧化鈣、鹽酸、碳酸氫銨等（分析純）。

XFB-500型高速中藥粉碎機（吉首市中湘制藥機械廠）；AL204-IC型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DLSB-5/20型低溫冷卻液循環泵（鄭州長城科工貿有限公司）；98-1-B型電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；N-1000S-WA型旋轉蒸發儀（東京理化器械株式會社）；OSB-2100型油浴鍋（東京理化器械株式會社）；PC 101NT型化學隔膜泵（德國vacuubrand公司）；Discovery型熱重分析儀（美國TA公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

在前期文獻調研及單因素試驗基礎上，選取對茶皂素提取影響較大的乙醇體積分數、液固比、浸提溫度、浸提時間等因素進行Box-Behnken試驗，以茶皂素提取率及純度為指標，采用Design-Expert軟件中的Box-Behnken試驗設計法優化茶皂素的提取工藝，其因素和水平數值見表1。

1.2.2 提取方法

取一定量經粉碎的冷榨油茶餅粕，用5倍量的石油醚50 ℃回流1 h，去茶油，過濾，殘渣用同樣的方法浸提一次過濾，揮發石油醚得脫脂油茶餅粕；將20 g脫脂油茶餅粕添加到500 mL圓底燒瓶中，用電熱套進行加熱浸提，各提取條件按Box-Behnken試驗設計方法來進行，趁熱過濾，并用同一浸提溶劑洗滌殘渣3次，合并濾液；待濾液濃縮成漿狀時，停止加熱，加入漿狀濾液質量10%明礬，充分攪拌15 min，靜置1 h后分離沉淀劑，即得漿狀茶皂素粗品，干燥后記為CZS-1。茶皂素提取率計算方法見式（1）。

1.2.3 純化方法

將漿狀茶皂素粗品加入圓底燒瓶，并加入質量5%氧化鈣，充分攪拌15 min，靜置1 h，過濾分離；將碳酸氫銨加入沉淀物中，使茶皂素轉化成液體，過濾，得茶皂素液體，干燥后記為CZS-2。

1.2.4 茶皂素含量測定

參照SN/T 1852—2006法[15]，并略有修改。精密稱取約1.5 g粉狀試樣置于三角燒瓶中，加10 mL去離子水溶解后加12 mL 36%鹽酸，接蛇形冷凝管置通風櫥中100 ℃回流2 h，取出冷卻至室溫，沉淀過濾洗滌至中性；將沉淀和濾紙置于85 ℃真空干燥箱中烘干，用濾紙包好置于索氏提取器內，用丙酮作溶劑，于75 ℃抽提2 h，回收丙酮至干，接收瓶和提取物放入110±2℃烘箱中干燥2 h，取出，放入干燥器中冷卻0.5 h后稱其質量，重復上述步驟，至前后2次質量之差不超過2 mg，即為恒質量。茶皂素含量計算方法見式（2）。

式中：W為茶皂素含量，%；m0為空白殘留物質量，g；m1為樣品質量，g；m2為接收瓶質量，g；m3為恒質量后接收瓶和抽提物質量，g。

1.2.5 熱穩定性分析

分別稱取約5 mg茶皂素樣品CZS-1和CZS-2，采用熱重分析儀以20 ℃/min升溫速率，從40 ℃升溫到750℃，N2為測試氣氛，氣體流速10 mL/min。

2 結果與討論

2.1 茶皂素的提取

2.1.1 模型及回歸方程的建立

Box-Behnken的四因素三水平試驗結果見表2，共29個試驗點。其中，試驗號10，14，17，19和27為中心試驗，其余為析因試驗。29個試驗點又可分為零點和析因點，其中零點為效應面的中心點，試驗重復5次，用于評估試驗誤差[16]；析因點為自變量值A、B、C、D所構成的四維頂點。茶皂素提取率及純度試驗值見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

選用模型Quadratic回歸方程分析法分析，可得各因素對茶皂素提取率及純度影響的多元回歸預測模型方程，如表3所示。

表3 響應指標的預測模型

2.1.2 方差分析

表4 提取率方差分析

表5 純度方差分析

由表4可知，以茶皂素提取率為響應值，模型p＜0.000 1，說明該模型極顯著，失擬項p=0.156 9＞0.100 0，表明該數學模型與試驗結果擬合較好，可用于推測試驗結果。多元方程相關系數為R2=0.903 1，可說明90.31%的數據可用此方程解釋。校正判定系數0.806 1，說明該數學模型能較好地預測提取條件與提取率之間的關系。由F值大小還可知，各因素對茶皂素提取率影響的主次順序為：A＞D＞B＞C，即乙醇質量分數＞液固比＞浸提溫度＞浸提時間。

由表5可知，以茶皂素純度為響應值，模型p＜0.000 1，說明模型極顯著，失擬項p=0.089 4＞0.100 0，表明該數學模型與試驗結果擬合較好，可用于推測試驗結果。多元方程相關系數R2=0.916 2，可說明91.61%的數據可用此方程解釋。校正判定系數0.832 3，說明該數學模型能較好地預測提取條件與提取率之間的關系。由表5可知，AD、BC的交互影響差異顯著，其他因素交互影響差異不顯著。

2.1.3 交互因子的響應面分析

等高線形狀可以反映各因素交互作用大小，其排列密集程度可表明各因素對響應指標的影響程度；響應曲面圖能直觀反映各因素對響應指標影響的整體趨勢[17]。根據Box-Behnken試驗結果和回歸方程，各因素對響應指標的影響可用等高線圖及響應面圖表示，在試驗中，乙醇體積分數、浸提溫度、浸提時間和液固比交互因子對響應指標的等高線圖和響應面圖如圖1和圖2所示。由圖1可知，在浸提溫度和浸提時間不變的情況下，響應面圖為一坡度較大曲面，說明各混料因子之間交互作用明顯。固定液固比，響應指標提取率先升后降，且有最大值，表明乙醇體積分數對茶皂素提取率影響較大，這與提取率方差分析結果一致。圖2描述各因素對茶皂素純度的影響作用，在浸提溫度和浸提時間不變的情況下，響應面圖為一坡度較大曲面，說明各因素之間交互作用明顯。固定乙醇體積分數，響應指標純度先升后降，且有最大值，表明液固比對茶皂素純度影響較大；由等高線圖可知，乙醇體積分數與液固比的交互作用顯著，這與純度方差分析結果一致。

2.1.4 驗證試驗

根據Box-Behnken試驗結果和回歸方程得到最優預測提取工藝，即乙醇體積分數83.73%、浸提溫度79.56 ℃、浸提時間3.10 h和液固比10.38∶1（mL/g）。在該工藝下，模型預測茶皂素提取率和純度分別為13.80%和63.86%。考慮試驗操作便利，優選工藝為：乙醇體積分數84%、浸提溫度80 ℃、浸提時間3 h和液固比10∶1（mL/g）。依據優選工藝進行茶皂素的提取，重復3次取平均值，茶皂素粗品（CZS-1）的提取率和純度分別為13.52%和63.92%，與預測值基本相符，表明優選工藝可用于茶皂素的提取。

圖1 交互因子對提取率影響的等高線圖和響應面圖

圖2 交互因子對純度影響的等高線圖和響應面圖

2.2 熱穩定性分析

為考察不同純度茶皂素熱穩定性能，將茶皂素粗品（CZS-1）按1.2.3的純化方法，可得精制茶皂素（CZS-2），其純度為86.24%。不同純度茶皂素熱降解行為見圖3和表6。由圖3可知，2個不同純度茶皂素的熱穩定性分別在低溫區和高溫區展示出不同的變化規律。分解溫度低于430 ℃，兩者的降解行為相似，但純度越高，茶皂素在低溫區的熱穩定性越差。這可能的原因是茶皂素純度越大，如—O—、—OH、—COO—、—COOH等強電負性的含氧親水基團含量也增大，在體系中更容易吸潮，且生成受熱容易降解的氫鍵。當分解溫度高于430 ℃時，兩者關系正好相反。由表2可知，茶皂素純度越高，其低溫區第一和第二階段最大分解溫度也隨之降低，該階段與水分的增加有關，說明茶皂素純度越高，體系越易吸潮，生成易降解的氫鍵。分解溫度700 ℃時，CZS-1和CZS-2的殘炭率分別為2.3%和21.5%。結果表明茶皂素純度越高，其高溫殘炭率越高。分析其原因可能是純度越高，體系中容易結碳的C—C五環結構比例就越大，促進材料在高溫區快速成碳，體系的感溫穩定性提高。

圖3 CZS-1和CZS-2的熱降解曲線

表6 CZS-1和CZS-2的熱降解數據

3 結論

在前期文獻調研及預試驗基礎上通過Box-Behnken試驗優化，獲得茶皂素提取的最佳工藝：乙醇體積分數84%、浸提溫度80 ℃、浸提時間3 h和液固比10∶1（mL/g）。在該工藝下，模型預測茶皂素提取率和純度分別為13.52%和63.92%。驗證試驗結果與預測值基本相符，試驗模型優化工藝與預測值可信度高，可用作茶皂素的提取工藝。

在相同升溫速率下，當分解溫度＜430 ℃時，茶皂素純度越高，其熱穩定性越差；當分解溫度＞430℃時，兩者關系正好相反。當分解溫度為700 ℃時，茶皂素純度越高，其高溫殘碳性能越好。