蒜酶HPLC定性檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

李心雨 ，羅春霞，敬爽，李新霞

1. 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（烏魯木齊 830011）；2. 石河子大學(xué)藥學(xué)院（石河子 832000）；3. 新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院（烏魯木齊 830054）

大蒜（Allium sativumL.）為百合科蔥屬植物蒜的鱗莖，是一種具有悠久歷史的藥食兩用植物[1]。蒜氨酸裂解酶（Alliinase，EC4.4.1.4）簡(jiǎn)稱蒜酶，是用來(lái)催化大蒜中活性成分蒜氨酸，使其裂解生成大蒜辣素[2-4]。大蒜辣素是公認(rèn)的大蒜活性成分，具有多種藥理活性作用[5-9]。蒜氨酸酶相對(duì)分子質(zhì)量為103 kDa[10]，大蒜粉末中蒜酶有兩個(gè)相同的亞基結(jié)構(gòu)，相對(duì)分子質(zhì)量為51.5 kDa[11]。一般常采用還原型SDSPAGE凝膠電泳法測(cè)定蒜酶相對(duì)分子質(zhì)量及蒜酶在大蒜總蛋白中的含量[12]，但是由于蒜酶結(jié)構(gòu)為雙亞基結(jié)構(gòu)[13]，在電泳測(cè)定前加入的載樣緩沖液首先使蒜酶中二硫鍵斷裂而最終檢測(cè)為蒜酶亞基，不能真實(shí)反映大蒜中的蒜酶分布情況。為了進(jìn)一步確定蒜酶含量和分布，建立蒜酶的HPLC檢測(cè)方法，被測(cè)蛋白與其他干擾物質(zhì)之間有很好的分離度[13-14]，試驗(yàn)采用高效分子排阻色譜（SEC-HPLC）法檢測(cè)蒜酶，根據(jù)凝膠色譜柱的分子篩原理，對(duì)蒜酶提取物中的蒜酶二聚體和亞基結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步研究大蒜及大蒜蒜酶提取物中的蒜酶分布和結(jié)構(gòu)特征。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與設(shè)備

LC-20AD-SPD-RID高效液相色譜儀（日本島津）；Exceed-E艾柯超純水機(jī)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）；M1-L213B微波爐（Midea集團(tuán)）；JYL-C020E勻漿機(jī)（九陽(yáng)股份有限公司）。

1.2 試劑與材料

磷酸氫二鈉（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)2013100801）；磷酸二氫鉀（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)20131007）；牛血清蛋白（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)L16M6S2，純度≥98%）；卵清蛋白（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)SLBM7240V，純度≥98%）。

不同產(chǎn)地大蒜凍干粉（新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)、山東大蒜、塔城博孜達(dá)克農(nóng)場(chǎng)大蒜、巴里坤農(nóng)豐園大蒜、巴里坤板房溝大蒜）；不同產(chǎn)地鮮蒜（新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)）；蒜酶提取物（新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)，批號(hào)201702011，201703013，201703012和201702024）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

蒜酶供試品溶液：精密稱取60 mg蒜酶提取物1置10 mL量瓶中，用純水溶解定容至刻度。

大蒜供試品溶液1：精密稱取約160 mg大蒜凍干粉置10 mL量瓶中，用純水溶解定容至刻度。

大蒜供試品溶液2：精密稱取約640 mg大蒜凍干粉置10 mL量瓶中，用純水溶解定容至刻度。

鮮蒜供試品溶液：取10 g去皮鮮蒜，精密稱定，加35 mL水，勻漿1 min，漿液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

牛血清蛋白溶液：稱取20 mg牛血清蛋白溶液，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用純水溶解定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

卵清蛋白溶液：稱取20 mg卵清蛋白溶液，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用純水溶解定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.2 HPLC測(cè)定蒜酶方法的建立

Kitamura等[15]采用C8柱測(cè)定蒜酶，參考文獻(xiàn)確定蒜酶在325 nm波長(zhǎng)下的色譜峰，具有專屬性，所以采用325 nm作為蒜酶提取物液相色譜檢測(cè)波長(zhǎng)。

精密稱定牛血清蛋白、卵清蛋白、大蒜凍干粉（供試品溶液2）、鮮蒜和蒜酶提取物，按2.1小節(jié)的方法制備供試品溶液。

色譜條件：采用TSK gel G3000SWXL（7.8 mm×300 mm，7 μm）色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm；流動(dòng)相：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（7.098 g磷酸氫二鈉，6.803 g磷酸二氫鉀，加水至1 000 mL）；流速0.5 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量15 μL。

采用凝膠色譜柱定性測(cè)定蒜酶提取物中蒜酶，根據(jù)凝膠色譜柱分子篩原理大相對(duì)分子質(zhì)量的物質(zhì)先出峰，即保留時(shí)間越短，相對(duì)分子質(zhì)量越大。牛血清蛋白和卵清蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別是66.4和44.5 kDa，在色譜圖中的保留時(shí)間分別是18.850和20.225 min（圖1）。蒜酶單個(gè)亞基相對(duì)分子質(zhì)量為51.5 kDa[10]，蒜酶二聚體相對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量為103 kDa。蒜酶提取物和大蒜凍干粉（圖2和圖3）在14和19 min處均有色譜峰出現(xiàn)，出峰時(shí)間較牛血清蛋白提前，可以確定在325 nm檢測(cè)波長(zhǎng)處，14 min的色譜峰為蒜酶二聚體峰，而另一個(gè)在牛血清蛋白和卵清蛋白保留時(shí)間之間的峰（19 min）可以確定為蒜酶的單個(gè)亞基峰。色譜圖結(jié)果還顯示，蒜酶提取過(guò)程，除去了部分大蒜蒜酶中蒜酶亞基結(jié)構(gòu)。

圖1 牛血清蛋白、卵清蛋白液相色譜圖

圖2 大蒜凍干粉中蒜酶HPLC測(cè)定液相色譜圖

圖3 蒜酶提取物中蒜酶HPLC測(cè)定液相色譜圖

2.3 大蒜凍干粉和蒜酶提取物中蒜酶的檢測(cè)

精密稱定不同批次蒜酶提取物和不同產(chǎn)地大蒜凍干粉，4批蒜酶提取物A1～A4，4個(gè)不同產(chǎn)地大蒜凍干粉G1～G4。按照2.1的方法制備蒜酶供試品溶液和大蒜供試品溶液1，按照2.2的色譜條件測(cè)定蒜酶提取物和大蒜凍干粉中的蒜酶。

表1 HPLC測(cè)定不同批次蒜酶提取物和大蒜提取物中蒜酶

根據(jù)大蒜凍干粉和蒜酶提取物中蒜酶及蒜酶亞基的峰面積測(cè)定結(jié)果，對(duì)比它們?cè)诖笏鈨龈煞酆退饷柑崛∥镏械南鄬?duì)含量。結(jié)果如表1和圖4所示，蒜酶提取物中蒜酶二聚體含量較高，且有些批次的蒜酶提取物不含蒜酶亞基，僅有蒜酶二聚體；大蒜凍干粉中蒜酶二聚體的含量較低，不同產(chǎn)地的大蒜凍干粉均含有蒜酶二聚體和蒜酶亞基。所以大蒜凍干過(guò)程中保留了蒜酶二聚體和亞基結(jié)構(gòu)，而經(jīng)過(guò)提取純化的蒜酶提取物中二聚體得以富集，亞基比例降低。

圖4 大蒜凍干粉和蒜酶提取物中蒜酶二聚體和亞基峰面積柱狀圖

2.4 不同產(chǎn)地大蒜凍干粉中蒜酶相對(duì)含量比較

精密稱定不同產(chǎn)地大蒜凍干粉，按照2.1的方法制備大蒜供試品溶液，采用2.2的色譜條件測(cè)定17個(gè)不同產(chǎn)地大蒜凍干粉。結(jié)果列入表2。

不同產(chǎn)地大蒜凍干粉的蒜酶HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，來(lái)源于17個(gè)產(chǎn)地大蒜凍干粉中蒜酶二聚體有較大差異，蒜酶二聚體峰面積均高于蒜酶亞基峰面積，兩者峰面積比值為2.75±0.79（均值±SD，n=17）。采用SPSS分析軟件對(duì)17個(gè)產(chǎn)地大蒜凍干粉中蒜酶二聚體和蒜酶亞基峰面積進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。相關(guān)分析結(jié)果顯示，蒜酶二聚體峰面積與蒜酶亞基峰面積的相關(guān)系數(shù)r=0.624，p值（Sig）=0.007＜0.05，表明兩者存在相關(guān)關(guān)系。同時(shí)按照建立的方法，對(duì)不同產(chǎn)地大蒜凍干粉中的蒜氨酸進(jìn)行測(cè)定，對(duì)蒜酶與蒜氨酸含量進(jìn)行相關(guān)關(guān)系分析，結(jié)果顯示蒜酶含量高低與蒜氨酸含量之間不存在相關(guān)關(guān)系。

2.5 滅酶處理方法對(duì)蒜酶二聚體和亞基含量的影響

按照2.1的方法制備鮮蒜供試品溶液和滅酶鮮蒜供試品溶液，采用2.2的色譜條件對(duì)不同產(chǎn)地鮮蒜進(jìn)行檢測(cè)。

圖6顯示，鮮蒜經(jīng)勻漿處理，有14 min處的蒜酶二聚體和19 min處蒜酶亞基色譜峰，而同一鮮蒜經(jīng)微波滅酶處理，檢測(cè)不到蒜酶的色譜峰，供試品溶液中蒜酶二聚體和蒜酶亞基色譜峰均消失。鮮蒜經(jīng)滅酶處理，蒜酶因變性而聚集沉淀，溶解度下降，在樣品前處理的過(guò)程中滅酶供試品溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，樣品溶液中蒜酶因沉淀而無(wú)法透過(guò)濾膜，所以HPLC方法檢測(cè)不到滅酶鮮蒜供試品的蒜酶色譜峰。

表2 不同產(chǎn)地大蒜凍干粉中蒜酶峰面積和蒜氨酸含量

圖5 不同產(chǎn)地大蒜凍干粉柱狀圖

圖6 鮮蒜滅酶和不滅酶處理液相色譜圖

表3 不同產(chǎn)地鮮蒜中蒜酶二聚體和蒜酶亞基峰面積

圖7 不同產(chǎn)地鮮蒜的蒜酶二聚體及蒜酶亞基峰面積柱狀圖

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)采用HPLC法分別測(cè)定蒜酶提取物、大蒜凍干粉和鮮蒜中蒜酶，在大蒜樣品中分別檢測(cè)到蒜酶和蒜酶亞基存在，而經(jīng)過(guò)提取純化的蒜酶提取物中蒜酶亞基含量減少。研究建立的方法與SDS-PAGE法比較，不用破壞蒜酶結(jié)構(gòu)，并且可以分別檢測(cè)到蒜酶和蒜酶亞基的色譜峰。據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道，蒜酶分子作為二聚體，具有生物活性，是由于它的活性位點(diǎn)由兩個(gè)亞基的殘基構(gòu)建，需組成二聚體才具有活性。所以蒜酶活力是由蒜酶二聚體結(jié)構(gòu)決定的，試驗(yàn)通過(guò)采用HPLC法檢測(cè)蒜酶中二聚體結(jié)構(gòu)，為后續(xù)提取純化蒜酶具有指導(dǎo)意義，為進(jìn)一步探索蒜酶催化蒜氨酸產(chǎn)生大蒜辣素的機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。

根據(jù)表3和圖7可知，不同產(chǎn)地鮮蒜中均含有蒜酶二聚體和蒜酶亞基，兩者峰面積比值為3.01±0.84（均值±SD，n=7）。表3顯示大蒜凍干粉中蒜酶二聚體與蒜酶亞基峰面積的比值為2.75±0.79（均值±SD，n=17），與鮮蒜中比值一致。所以鮮蒜經(jīng)冷凍干燥處理，不影響鮮蒜中蒜酶二聚體及亞基結(jié)構(gòu)，而微波處理后蒜酶變性，使其溶解度下降而未能檢出。

對(duì)不同產(chǎn)地的鮮蒜中的蒜酶二聚體和蒜酶亞基峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)相關(guān)分析，結(jié)果顯示，相關(guān)系數(shù)r=0.852，p值（Sig）=0.015＜0.05，表明蒜酶二聚體峰面積與蒜酶亞基峰面積存在相關(guān)關(guān)系。對(duì)不同產(chǎn)地鮮蒜中蒜酶峰面積與蒜氨酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示蒜酶峰面積與蒜氨酸含量之間不具有相關(guān)關(guān)系。這一結(jié)果與大蒜凍干粉一致。