酶法制備雞血抗氧化肽及其抗氧化活性

寧芯 ，黎梓玉，班薇薇，黃小惠，莫紫梅，汪磊 *

1. 廣西農產資源化學與生物技術重點實驗室（玉林 537000）；2. 廣西高校桂東南特色農產資源高效利用重點實驗室（玉林 537000）；3. 玉林師范學院化學與食品科學學院（玉林 537000）；4. 廣西-東盟食品檢驗檢測中心（南寧 530001）

自由基是需氧生物在正常生理過程中產生的一類性質活潑的化學物質，這類物質在生物機體內扮演重要作用，包括信號傳遞、預防感染和排除毒素等[1]。自由基在正常生物機體內處于動態平衡，若失衡，長期過量的自由基通過與脂類、蛋白質和核酸等生物大分子作用，易引發癌癥、心腦血管疾病、關節炎癥、老年性視力障礙等疾病。據統計，自由基侵害約占影響人體健康因素的85%[2-3]。

適量攝入具有抗氧化活性的物質能有效降低機體的自由基水平，防止脂類物質過氧化，提高機體免疫力[4]。各類抗氧化物質中，從某些動植物組織中提取的天然抗氧化劑具有抗氧化能力強、穩定性強和安全性高等特點，深受消費者青睞，但其含量普遍較低[5-6]，實際意義不大。科研人員在近期研究過程中發現：可控酶法水解蛋白質制備具有抗氧化活性的多肽具有反應溫和、可控性好和安全性高等優點，是當前生產天然抗氧化劑的主要方法[7]。

據統計，我國肉雞年出欄量高達40億只，肉雞含血量在80～100 g/只，粗略估計，雞血年產量約36萬 t，數量相當可觀[8]。研究表明：雞血干物質含量約17.9%，其中91.8%為優質蛋白質[9]，是一種具有良好開發潛力的蛋白質資源。豬血[10]、牛血[11]、鵝血[12]和鴨血[13]等畜禽動物血液均可作為廉價蛋白質來源制備抗氧化肽，而當前我國雞血主要經過簡單加工后作為飼料添加物使用，附加值極低。基于此，趙亮等[14]、鄭召君等[15]和曾利平等[16]嘗試以雞血血球為原料制備抗氧化肽，但制備過程中產生大量的雞血血漿（以體積計，血漿約占血液的55%），降低了雞血蛋白的利用率，影響雞血的高值化利用。此次試驗以新鮮雞血為原料，通過滲透吸水破壞雞血血球細胞結構，在此基礎上采用酶法水解制備雞血抗氧化肽，研究各單因素（pH、加酶量、酶解溫度和酶解時間）對雞血酶解產物還原能力的影響，并采用響應面法優化雞血酶解條件，旨在為雞血高值化利用提供有益途徑和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

新鮮雞血（取自白羽肉雞，市售）；堿性蛋白酶（生化試劑，2×105U/g，北京奧博星生物技術有限責任公司）；氫氧化鈉、鹽酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸等（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

電子天平（AR224CN型，奧豪斯儀器（常州）有限公司）；磁力攪拌水浴鍋（SHJ-2A型，常州金壇良友儀器有限公司）；臺式高速離心機（H1850R型，長沙湘儀離心機儀器有限公司）；實驗室pH計（ST2100型，奧豪斯儀器（常州）有限公司）；紫外-可見分光光度計（UV-1600型，上海美譜達儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 雞血抗氧化肽的制備工藝

新鮮雞血→加入濃度為4%的抗凝劑（檸檬酸鈉）→破胞（加3倍體積蒸餾水充分攪拌）→熱變性處理（90 ℃，20 min）→冷卻→調pH→堿性蛋白酶水解→滅酶（沸水浴10 min）→離心（3 500 r/min，15 min）→取上清液→分析檢測

1.3.2 還原能力的測定

參照Ye等[17]的方法。取2.5 mL雞血酶解液，分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL 10 mg/mL鐵氰化鉀，充分混勻，于50 ℃水浴20 min，再加入2.5 mL 100 mg/mL三氯乙酸，混勻后10 000 r/min離心15 min，取2.5 mL上清液，分別加入0.5 mL 1 mg/mL三氯化鐵和2.0 mL蒸餾水，混勻后于700 nm波長比色。

1.3.3 清除DPPH自由基能力測定

參考Wu等[18]的方法，配制不同濃度的雞血酶解物溶液，于517 nm波長比色，計算溶液清除DPPH自由基能力。

1.3.4 清除羥自由基能力測定

參考王強等[19]的方法，配制不同濃度的雞血酶解物溶液，于536 nm波長比色，計算溶液清除羥自由基能力。

1.3.5 單因素試驗

試驗分別以pH（8.0，9.0，10.0，11.0和12.0）、加酶量（4 000，6 000，8 000，10 000和12 000 U/g）、酶解溫度（40，45，50，55和60 ℃）和酶解時間（20，40，60，80和100 min）為影響因素進行單因素試驗，研究單因素對雞血酶解物還原能力的影響。

1.3.6 響應面試驗

基于單因素試驗結果，根據Box-Behnken中心組合設計（BBD）的試驗原理，選取對雞血酶解物還原能力有顯著性影響的pH、加酶量、酶解溫度和酶解時間為自變量，以雞血酶解物的還原能力為響應值，采用四因素三水平的響應面分析法優化雞血酶解工藝。響應面因素水平編碼表見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素和水平

1.4 統計處理

應用SPSS 17.0軟件和Design-Expert 8.0軟件處理試驗數據。采用Duncan檢驗進行顯著性分析，p＜0.05判定為變化顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 pH

pH對雞血酶解物還原能力影響顯著（圖1），雞血酶解物還原能力隨pH的增大呈現先增大后下降的趨勢。當pH為11.0時，雞血酶解物的還原能力最強。其主要原因是試驗所用堿性蛋白酶的最適pH為11.0，如偏離蛋白酶的最適pH，酶活明顯降低，影響酶解物的水解度和還原能力。

2.1.2 加酶量

加酶量顯著影響雞血酶解物的還原能力。圖1表明：在4 000～10 000 U/g范圍內，雞血酶解物的還原能力隨加酶量的增加而增強，當加酶量超過10 000 U/g時，雞血酶解物還原能力變化不顯著。其原因可能是在一定的底物質量濃度下，增加酶用量提高了堿性蛋白酶與雞血蛋白的結合率，進而加快了酶解的速率，但當酶蛋白分子過于飽和后，酶解速率無顯著性增大，酶解產物的還原能力趨于平穩，如繼續加大蛋白酶的用量反而會增加生產成本，因此選擇10 000 U/g作為最適加酶量。

2.1.3 酶解溫度

通常情況下，酶促反應隨著溫度的升高而加快，但是當溫度超過一定范圍后，酶的活性隨之下降甚至會變性失去活性。試驗研究了酶解溫度對雞血酶解物還原能力的影響，結果見圖1。酶解溫度對雞血酶解物還原能力影響顯著，隨溫度的升高，雞血酶解物的還原能力呈先上升后下降的趨勢，當酶解溫度為45 ℃時，雞血酶解物的還原能力最大。

2.1.4 酶解時間

圖1表明：雞血酶解物還原能力隨酶解時間的延長呈先上升后下降的趨勢，當酶解時間為80 min時，雞血酶解物還原能力最大，進一步延長酶解時間，雞血酶解物還原能力反而大幅度下降。其原因可能是隨著酶解時間的延長，具有還原能力的肽段進一步水解，形成了還原能力較小或不具還原能力的肽段[20]。

圖1 各因素對雞血酶解物還原能力的影響

2.2 響應面法優化雞血抗氧化肽酶解工藝

2.2.1 試驗設計與結果

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計原理，選取pH（A）、加酶量（B）、酶解溫度（C）和酶解時間（D）為影響因素，以雞血酶解物還原能力為響應值，進行四因素三水平的響應面分析，試驗方案及結果見表2。

2.2.2 回歸方程方差分析

利用Design-Expert 8.0對試驗結果進行多元回歸擬合，得到以雞血酶解物還原能力（Y吸光度）對各因素的回歸方程：

Y=0.57+0.068A+0.034B+0.026C-5.833×104D-0.029AB+5.500×105AC-0.020AD+8.900×103BC-3.400×103BD+5.500×103CD-0.096A2-0.076B2-0.12C2-0.046D2

2.2.3 模型及回歸方程系數的顯著性檢驗

對回歸模型方差進行分析，結果見表3。該模型的p=0.000 1＜0.01，說明試驗所選用的模型具有高度的顯著性，試驗設計方案正確，可以用來預測響應值。模型中A、A2、B2和C2對雞血酶解物還原能力影響極顯著，B和D2對雞血酶解物還原能力影響顯著，其他項系數均不顯著。在選取的因素水平范圍內，按照對結果的影響排序，pH＞加酶量＞酶解溫度＞酶解時間。失擬項F值為913.98，表明數據中有少量異常點。

根據分析結果繪制響應面曲面圖，結果如圖2所示。等高線是橢圓形，則表示兩因素交互作用顯著，同時沿因素軸向等高線變化越密集，則該因素對響應值影響越顯著，反之越弱[21]。由圖2可知，4個因素對雞血酶解物還原能力影響大小順序依次為pH＞加酶量＞酶解溫度＞酶解時間，結果與表3一致。

表2 響應面試驗設計與結果

表3 回歸方程方差分析

圖2 各因素對雞血酶解物還原能力影響的響應面圖

2.2.4 最佳酶解工藝條件的驗證結果

通過Design-Expert 8.0軟件得到堿性蛋白酶酶解雞血的最佳工藝參數：pH 11.34，加酶量10 335 U/g，酶解溫度45.56 ℃和酶解時間78.41 min。在該條件下，雞血酶解物還原能力的吸光度預測值為0.581 8；考慮到實際的可操作性，將上述工藝參數調整為pH 11.3，加酶量10 335 U/g，酶解溫度46 ℃和酶解時間78 min。對調整后的優化的條件進行驗證試驗，結果表明，雞血酶解物還原能力的吸光度為0.570 1，與理論預測值基本吻合，因此基于響應面法所得的優化酶解參數是準確可靠的。

2.3 雞血酶解物主要組成成分及抗氧化活性

雞血酶解后凍干，檢測其主要組成成分，結果見表4。雞血酶解物凍干粉粗蛋白含量高達71.15%，脂肪含量低于1%，是典型的高蛋白低脂類原料。值得注意的是，由于酶解過程中需加入較多的酸堿試劑調節酶解所需的pH，雞血酶解物凍干粉的灰分含量接近20%，因此后續使用中需進行脫鹽處理。

表4 雞血酶解物主要組成成分

表5 雞血酶解物體外抗氧化能力

將雞血酶解物凍干粉配制成不同濃度的溶液，研究雞血酶解物在化學模擬體系中的抗氧化活性，結果見表5。雞血酶解物的還原能力隨濃度的增大而增強，且在該范圍內呈現較好的量效關系（R2=0.94）。雞血酶解物具有良好的清除羥自由基的能力，且與濃度呈顯著正相關（R2=0.97），當雞血酶解物的質量濃度為15.0 mg/mL時，羥自由基的清除率高達99.2%。此外，雞血酶解物還具備一定清除DPPH自由基的能力，15 mg/mL雞血酶解物DPPH清除率為64.58%。

3 結論

1) 以新鮮雞血為原料，采用滲透吸水破壞雞血血球細胞結構，在此基礎上應用響應面分析法優化雞血的酶解工藝。結果表明，雞血酶解的最佳參數為pH 11.3，加酶量10 335 U/g，酶解溫度46 ℃，酶解時間78 min。與以往酶法水解雞血球制備抗氧化肽相比，該方法有利于雞血蛋白的充分利用。

2) 體外抗氧化活性試驗證實雞血酶解物具有良好的抗氧化能力，15.0 mg/mL的雞血酶解物DPPH自由基清除率和羥自由基的清除率分別為64.58%和99.2%，可有望作為天然抗氧化劑和功能性食品原料。