在線固相萃取-液相法測定新疆南瓜中生育酚

林毅侃，印杰，林琳，張雯，黃雨晴，葛宇

上海市質量監(jiān)督檢驗技術研究院/國家食品質量監(jiān)督檢驗中心（上海）（上海 200233）

南瓜是一年生蔓生草本植物，由于其抗逆能力強、適應性強、產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值高，在世界各地均有種植，尤以亞洲栽培面積最多[1]。南瓜由17%的皮、73%的果肉和10%左右的南瓜瓤組成[2]。南瓜中營養(yǎng)豐富并且全面，富含果膠、纖維素、淀粉、脂肪、甘露醇、各種水溶性維生素、生物堿、β-蘿卜素和生育酚等[3-6]。

生育酚為脂溶性維生素的一種，是維持機體正常生長、發(fā)育、代謝和其基本生理所需功能的必要物質，具有抗氧化、防止衰老、提高機體免疫力、保護肝臟功能、抗腫瘤和預防心腦血管疾病等功效。然而生育酚在結構上極其不穩(wěn)定，在光照、氧氣、高溫及極端pH條件下極易被破壞[7-9]。脂溶性維生素的有關檢測方法主要有比色法、熒光法、分光光度法、電化學法、免疫分析法、高效液相色譜法[10-12]。國家標準規(guī)定的是使用高效液相色譜法進行測定。方法采用將樣品在高濃度堿性條件下進行皂化后再進行液液分配和濃縮步驟，需要采用復雜的前處理，消耗大量有機試劑，并涉及多次蒸發(fā)和溶解步驟。耗費大量人力物力的同時，也增加試驗難度，復雜的檢測步驟導致生育酚損失，造成回收率下降，待測成分被破壞等情況。試驗采用在線固相萃取-高效液相色譜技術，建立同時檢測4種生育酚的方法。該方法具有分析效率高、前處理簡單、試驗試劑消耗少、結果重復性好等特點，不僅縮短分析時間，也減少試驗步驟過于繁瑣所帶來的系統(tǒng)誤差及目標物的損失，并對不同產(chǎn)地來源的南瓜樣品中的生育酚進行測定，以期為南瓜中生育酚的快速檢測和深入研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜（上海艾妮維農(nóng)產(chǎn)品專業(yè)合作社從新西蘭引進的小南瓜品種，所需樣品均采自新疆喀什地區(qū)澤普縣的南瓜試驗示范種植基地；樣品于2018年4月26日播種、2018年6月5日開花；其余南瓜均為市售；見表1）。

α-生育酚（標準品，SIGMA公司）；γ-生育酚（標準品，SIGMA公司）；δ-生育酚（標準品，SIGMA公司）；氫氧化鉀（分析純，國藥）；乙腈（色譜純，國藥公司）；甲醇（色譜純，國藥公司）；乙醇、超純水（自制）。

表1 試驗用南瓜信息

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（Agilent-1260）、六通閥（1個）、安捷倫1260四元泵，安捷倫二元泵，紫外檢測器；色譜柱：BE ONLINE PLRP-S，2.1 mm×12.5 mm、Poroshell PFP，3.0 mm×100 mm。天平（METTLER TOLEDO公司）；離心機；超聲儀；水浴鍋；等。

1.3 標準溶液的配制

分別精確稱取0.100 0 g 4種生育酚標準樣品各于100 mL容量瓶中，用乙醇進行定容，得到質量濃度1.0 g/L標準儲備液，此1 mL溶液相當于1.0 mg生育酚。用該儲備液配制成4種生育酚混合標準液。

1.4 色譜條件

Online SPE泵，安捷倫1260四元泵；液相泵，安捷倫二元泵；檢測器，紫外檢測器；SPE柱，BE ONLINE PLRP-S，2.1 mm×12.5 mm；液相分析柱Poroshell PFP，3.0 mm×100 mm；流動相：SPE泵，水-乙醇（20∶80，V/V），流速1.0 mL/min；液相分離泵，甲醇-乙腈（梯度洗脫，洗脫條件見表2），流速1.0 mL/min。液相色譜柱柱溫：室溫（30 ℃左右）；閥切換時間0.00 min（位置1～2），4.00 min（位置1～6），15.00 min（位置1～6）。檢測波長294 nm；進樣體積100 μL。裝置連接示意見圖1。

圖1 液相色譜裝置連接示意圖

表2 液相泵梯度洗脫表

1.5 樣品處理

稱取3 g待測樣品，加入10 mL溫水渦旋溶解后，加入10 mL乙醇和4 mL 50%氫氧化鉀水溶液，放入82℃水浴鍋皂化20 min，冷卻后用1∶1乙醇水溶液定容至50 mL，離心過0.22 μm濾膜進樣。

2 結果與討論

2.1 系統(tǒng)流路的配置和一維色譜閥切換時間的確定

生育酚檢測前處理非常復雜，需要樣品在強堿溶液皂化后使用乙醚、石油醚等有機試劑液液分配萃取，水洗多次，旋轉蒸發(fā)等提取步驟，操作繁瑣，對人員操作要求較高。因此會造成檢測效率低下、數(shù)據(jù)誤差偏大等問題。基于此，試驗對系統(tǒng)流路進行優(yōu)化，在普通液相的前端，增加一根以剛性高聚合物為填料的能夠耐強堿的PLRP-S凈化柱。該配置可以滿足直接使用強堿的皂化液進行生育酚的檢測。同時PLRP-S凈化柱具有反向色譜吸附分離原理，在1 mL—水甲醇流動相條件下，皂化液中的目標物質會被吸附于凈化柱上，在經(jīng)過Online SPE泵數(shù)分鐘的流動相沖洗后，堿液及部分雜質被沖洗進入廢液管路，保護后續(xù)用于分離的液相色譜柱及儀器系統(tǒng)不收任何破。經(jīng)過六通閥的轉換，液相泵的流動相進入凈化柱內(nèi)，將目標物質洗脫入液相分析柱進行色譜分離。通過連續(xù)進樣，確定在4 min左右的SPE沖洗時間，洗脫液的pH達到中性，并且富集在凈化柱上的生育酚并沒有損失，因此確定六通閥的最終切換時間為4 min。

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

普通的C8或者C18色譜柱無法分離β-生育酚和γ-生育酚。使用PFP為填料的色譜柱，由圖2和圖3可見，在洗脫溶劑為甲醇和乙腈的情況下，PFP色譜柱可以很好地分離4種不同的生育酚。考慮到在切換流動相后，必須使用高濃度的有機相才能將SPE柱上富集的生育酚迅速、完全地沖洗下來，并且還需要保證4種生育酚的分離度及其與樣品液中殘留雜質的分離度，液相條件采用梯度洗脫。

圖2 4種生育酚色譜圖

圖3 南瓜樣品色譜圖

2.3 生育酚的定量檢出限

前處理簡化萃取和濃縮的步驟，相應地增大樣品的稀釋倍數(shù)，為了能夠達到國家規(guī)定的檢出限，方法將進樣量擴大到100 μL。使用空白樣品進行加標試驗（加標量0.120 mg/100 g），結果表明在進樣量100 μL條件下，色譜峰相應較高，能夠準確積分和定量，該試驗條件能夠滿足國標要求的檢出限。

2.4 線性關系

按1.4色譜條件，吸取標準系列溶液各100 μL進行進樣檢測。以標準系列溶液的質量濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，作標準曲線（圖4～圖6），并進行線性回歸得到標準曲線方程。

α-生育酚：Y=41.317 02X+1.164 08，r2=0.999 81。δ-生育酚：Y=29.487 80X-0.768 598，r2=0.999 91。γ-生育酚：Y=43.798 04X-1.004 96，r2=0.999 67。

圖4 α-生育酚標準曲線

圖5 γ-生育酚標準曲線

圖6 δ-生育酚標準曲線

2.5 回收率和精密度

分別在南瓜樣品中添加0.120，0.240，0.600和1.20 mg/100 g的4種生育酚，每個水平重復測定6次，外標法定量，扣去本底后結果見表3。

表3 空白南瓜基質中α-生育酚、γ-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚加標收率及相對標準偏差（n=6）

2.6 樣品測定

采用方法對表1所列的18份南瓜樣品進行測定。結果見表4。

表4 南瓜樣品檢測含量 mg/100 g

3 結果與展望

試驗在普通液相的配置上增加一泵一閥，搭建在線固相萃取-高效液相色譜法直接檢測南瓜樣品皂化液中的3種生育酚。方法檢出限與GB 5009.82—2016保持一致，且測定結果的重復性好，加標回收準確可靠。以此色譜條件測定的18份南瓜樣品中的生育酚含量差異明顯，新疆喀什種植的南瓜的生育酚含量普遍高于其余品種的南瓜，營養(yǎng)價值明顯。

方法從原理上可以滿足各種不同基質的食品中的檢測，不僅限于南瓜產(chǎn)品，在后續(xù)試驗中，可進一步測試其他基質食品，完善數(shù)據(jù)，增大方法適用性。