響應(yīng)面法優(yōu)化螺旋藻蛋白部分酶解工藝

陳小杏，劉慧，張少斌*，趙嶝科，辛橋，劉金洲

1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院（沈陽 110866）；2. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院（沈陽 110866）

螺旋藻是一種低等原核生物，屬于藍(lán)藻門，藍(lán)藻綱，段殖體目，顫藻科，螺旋藻屬[1-2]。螺旋藻營養(yǎng)成分豐富而均衡，含有多種生物活性物質(zhì)，如藻膽蛋白、螺旋藻多糖、不飽和脂肪酸、β-胡蘿卜素、維生素E、各種微量元素等，具有抗氧化、降血壓、降血脂、提高機(jī)體免疫力、防癌抑癌、延緩衰老等多種生理功能[3-4]。

相比于動(dòng)物蛋白，植物蛋白不僅來源廣泛、成本低廉，而且植物性蛋白食品幾乎不含膽固醇，飽和脂肪酸少，對(duì)人體健康更有利。然而，植物蛋白相對(duì)分子質(zhì)量較大，同時(shí)受到纖維素的影響，不易消化吸收[5]。因此，利用物理、化學(xué)以及酶學(xué)方法，體外將植物蛋白部分降解為生物肽和氨基酸，不僅可以提高蛋白質(zhì)的吸收利用率，而且可以去除某些蛋白的免疫原性[6-9]。從螺旋藻中提取螺旋藻蛋白，并將其部分水解制備螺旋藻肽，不僅提高螺旋藻蛋白質(zhì)吸收利用率，去除螺旋藻藻腥味，提高食品適口性，而且還可以從中分離制備具有特殊生理功能的生物活性肽[10-13]。

目前，酶解螺旋藻使用的原材料基本都是螺旋藻干粉[14-17]，螺旋藻在干燥過程中，部分蛋白質(zhì)會(huì)變性降解。因此，此次試驗(yàn)采用鮮活螺旋藻分離蛋白質(zhì)，選用5種蛋白酶對(duì)螺旋藻蛋白進(jìn)行水解，確定最優(yōu)水解條件，為螺旋藻蛋白的綜合開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺旋藻（鈍頂螺旋藻直線突變株，SP-Dz，實(shí)驗(yàn)室自養(yǎng)）；各種蛋白酶（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

HH-4恒溫水浴鍋（常州國華有限公司）；FA2104A電子分析天平（上海新諾儀器設(shè)備有限公司）；TGL-16高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)公司）；722型分光光度計(jì)（山東高密彩虹分析儀器有限公司）；pH-25酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；FD-1冷凍干燥機(jī)（北京德天佑科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 螺旋藻蛋白的酶解

采用凍融法裂解新鮮螺旋藻[8]，在10 000g下離心15 min，棄去沉淀，得到螺旋藻蛋白提取液。將適量螺旋藻蛋白溶液加入試管，放入水浴鍋中，調(diào)節(jié)水浴鍋的溫度使其達(dá)到適宜的酶解溫度，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)膒H，并按照比例加入蛋白酶，進(jìn)行酶解。在達(dá)到酶解時(shí)間時(shí)，將螺旋藻蛋白酶解溶液放入95 ℃水浴鍋中迅速滅酶10 min，冷卻后，在10 000g下離心30 min，棄去沉淀，測(cè)定上清液的水解度。

1.2.2 水解度的測(cè)定方法

參照孫媛媛等[18]的方法。采用凱氏定氮法測(cè)定酶解液中的總氮含量，采用甲醛滴定法測(cè)定α-氨基氮含量，然后按式（1）計(jì)算水解度。

水解度=上清液中α-氨基氮含量/上清液總氮含量×100% （1）

1.2.3 單因素試驗(yàn)方法

1.2.3.1 酶加入量的確定方法

取6個(gè)10 mL試管，分別加入1 mL螺旋藻蛋白質(zhì)提取液，分別加入濃度1%～6%的蛋白酶，酶解3 h，測(cè)定酶解產(chǎn)物的水解度。

1.2.3.2 酶解溫度的確定方法

分別于6個(gè)10 mL試管中加入1 mL螺旋藻蛋白質(zhì)提取液，依次加入3%的蛋白酶，酶解溫度設(shè)定范圍為35～75 ℃，酶解3 h，測(cè)定酶解產(chǎn)物的水解度。

1.2.3.3 酶解時(shí)間的確定方法

分別向6個(gè)10 mL試管中加入1 mL螺旋藻蛋白質(zhì)提取液，依次加入3%的蛋白酶，分別酶解1～6 h，測(cè)定酶解產(chǎn)物的水解度。

1.2.3.4 pH的確定方法

依次向6個(gè)10 mL試管中加入1 mL螺旋藻蛋白質(zhì)提取液，加入3%的蛋白酶，pH設(shè)定范圍為5.5～11.0，酶解3 h，測(cè)定酶解產(chǎn)物的水解度。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解螺旋藻蛋白工藝

通過Design Expert 7.0軟件中Box-Behnken Design（簡(jiǎn)稱BBD）的設(shè)計(jì)方法[19]，選定酶加入量、酶解溫度和酶解時(shí)間3個(gè)因素，設(shè)計(jì)3個(gè)試驗(yàn)水平，以水解度為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析，進(jìn)行水解條件的優(yōu)化。響應(yīng)面分析因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶加入量對(duì)螺旋藻蛋白水解的影響

酶加入量是影響酶解效果的基本因素。如圖1所示，酶加入量在1%～5%范圍內(nèi)，水解度隨著酶加入量的增加而線性增加。但酶加入量增加，不僅可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解過度，氨基酸含量增加，生物活性肽含量下降，而且還會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。在5種蛋白酶中，木瓜蛋白酶水解度最高，風(fēng)味蛋白酶水解度最低。

圖1 酶加入量對(duì)水解度的影響

2.1.2 酶解溫度對(duì)螺旋藻蛋白水解的影響

如圖2所示，不同蛋白酶最適作用溫度不同，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶最適溫度為55 ℃，胰蛋白酶最適溫度為50 ℃，中性蛋白酶最適溫度為45 ℃，風(fēng)味蛋白酶最適溫度為40 ℃。在酶的最適作用溫度條件下，螺旋藻蛋白水解度最大，在5種蛋白酶中，木瓜蛋白酶水解度最高。低于最適溫度，水解度隨溫度增加而增加，高于最適溫度，由于酶蛋白變性，水解度隨溫度增加而下降，這與大多數(shù)酶的理化特性相同[20]。

圖2 酶解溫度對(duì)水解度的影響

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)螺旋藻蛋白水解的影響

如圖3所示，在3 h內(nèi)，5種蛋白酶對(duì)螺旋藻蛋白的水解度均呈線性增加；4 h后，水解度增加緩慢，直至停止。其中，木瓜蛋白酶的水解度遠(yuǎn)高于堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

2.1.4 pH對(duì)螺旋藻蛋白水解的影響

如圖4所示，不同蛋白酶的最適作用pH不同。木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的最適pH為6.5，中性蛋白酶的最適pH為7.0，胰蛋白酶的最適pH為8.0，堿性蛋白酶的最適pH為10.0。低于最適pH，水解度隨pH增加而增加，高于最適pH，水解度隨pH增加而下降，這是由于pH會(huì)影響酶和底物可解離基團(tuán)的帶電情況，從而影響酶與底物的相互作用，這與大多數(shù)酶的理化特性相同[20]。

圖4 pH對(duì)水解度的影響

從前述單因素試驗(yàn)可以看出，在相同條件下，木瓜蛋白酶水解度最大，風(fēng)味蛋白酶水解度最小，其他酶的水解度居中。因此，選擇木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白，并用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，木瓜蛋白酶對(duì)螺旋藻蛋白溶液酶解3 h后，其水解度增加緩慢，因此固定酶解時(shí)間3 h，選擇pH、酶加入量和酶解溫度3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。在三因素三水平上設(shè)計(jì)17組試驗(yàn)，并按照設(shè)計(jì)方案分別進(jìn)行試驗(yàn)，得出各自的水解度，即響應(yīng)值，如表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸方程

將試驗(yàn)中各響應(yīng)值輸入軟件，通過Design Expert 7.0軟件中ANOVA對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。軟件對(duì)各個(gè)因素水平進(jìn)行擬合，得到二次響應(yīng)面回歸方程：

2.2.2 方差分析

從表3可以看出，一次項(xiàng)A（pH）和B（酶加入量）對(duì)解離度的線性效應(yīng)極顯著，C（溫度）對(duì)解離度的線性效應(yīng)顯著。由F值大小可以看出，最適pH對(duì)螺旋藻蛋白溶液的水解度影響最大，其次是酶加入量，酶解溫度的影響最小。二次項(xiàng)A2，B2和C2對(duì)解離度的線性效應(yīng)均為極顯著。兩因素的交互影響中，AB不顯著，AC顯著，BC極顯著，說明A，B，C三項(xiàng)之間有交互作用，且相互影響非常復(fù)雜。同時(shí)，模型的F=37.92，p值極顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.979 9，表明模型的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間有很高的相關(guān)性，校正相關(guān)系數(shù)為0.954 1，表示試驗(yàn)所建立的模型可以解釋95.41%的響應(yīng)值的變化，信噪比為17.245，變異系數(shù)為2.09%，表明該模型可信度高，誤差很小，能很好反映各因素與水解度的關(guān)系，可以用該模型預(yù)測(cè)螺旋藻蛋白的水解度。

表3 響應(yīng)面方差分析

2.2.3 響應(yīng)面分析

通過Design Expert 7.0軟件Model Graphs得到響應(yīng)曲面三維圖。固定酶解溫度55 ℃，由圖5可知pH的影響更大。固定酶加入量4%，由圖6可知pH的影響更大。固定pH 6.5，由圖7可知酶加入量的影響更大。綜合上述結(jié)果，當(dāng)某一因素確定為特定水平后，另外2個(gè)因素與水解度響應(yīng)值之間均呈二次曲面關(guān)系，3個(gè)因素在各自的水平變化內(nèi)均呈拋物線，隨著某一因素的增加，水解度增加，但達(dá)到一定值后，就會(huì)隨著其增加而減小，每一曲面中，水解度均有一最大值。

圖5 pH與酶加入量交互作用響應(yīng)面三維圖

圖6 pH與酶解溫度交互作用響應(yīng)面三維圖

圖7 酶解溫度與酶加入量交互作用響應(yīng)面三維圖

2.2.4 相應(yīng)因素水平的最優(yōu)化

利用Design Expert 7.0軟件，通過Optimization下的Numerical對(duì)響應(yīng)面模型進(jìn)行數(shù)據(jù)的最優(yōu)化處理，得到模型的優(yōu)化工藝條件為A=6.40，B=4.22，C=54.99，Y=26.846 1，即當(dāng)最適pH為6.40，酶加入量為4.22%，酶解溫度為54.99 ℃時(shí)，預(yù)測(cè)的水解度值最高，達(dá)到26.846 1%。為了在實(shí)際操作中更為簡(jiǎn)便，實(shí)際試驗(yàn)在pH 6.5、酶加入量4%、酶解溫度55 ℃條件下進(jìn)行測(cè)定，其水解度為26.678 0%，與理論預(yù)測(cè)值十分接近，說明該模型所建立的二次回歸方程與實(shí)際情況擬合度高，可靠性良好，可以將其作為模型來預(yù)測(cè)水解度與最適pH、酶加入量和酶解溫度之間的關(guān)系。

3 結(jié)論

以水解度作為檢測(cè)螺旋藻蛋白質(zhì)酶解程度的指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)，確定木瓜蛋白酶的水解度最高；堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶水解效果類似，居中；風(fēng)味蛋白酶的水解度最差。選取對(duì)螺旋藻蛋白溶液水解效果最好的木瓜蛋白酶做多因素試驗(yàn)，通過響應(yīng)面分析，得到木瓜蛋白酶的最適反應(yīng)條件，實(shí)際操作條件為：pH 6.5，酶加入量4%，酶解溫度55 ℃。此時(shí)水解度為26.678 0%，與模型預(yù)測(cè)值26.846 1%非常接近，預(yù)測(cè)模型可靠性高，可為螺旋藻蛋白質(zhì)水解的相關(guān)研究以及實(shí)際生產(chǎn)等工作提供理論依據(jù)。