血府逐瘀湯通過影響BMP9表達抑制Notch信號通路調節髓核細胞增殖的機制

郭義 林俊

(萍鄉市中醫院骨科，江西 萍鄉 337000)

椎間盤退變是由多種因素引起的一種退行性疾病。隨著人口老齡化和預期壽命的延長，發病率逐漸增加，給患者帶來了極大的痛苦和沉重的社會負擔〔1〕。髓核變性是早期椎間盤退變的主要病理變化，表現為細胞外基質(ECM)的逐漸變化。ECM主要由聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原(Col2a1)組成，且其逐漸減少，Ⅰ型膠原取代Col2a1，導致纖維化和彈性模量的損失〔2〕。髓核變性治療的相應缺陷包括手術或保守治療。據推測，隨著衰老和變性，髓核細胞經歷表型轉化并被分泌非典型纖維ECM的成纖維細胞所取代〔3〕。這表明細胞微環境的變化和分解代謝介質的存在可能促進異常增殖和分化。細胞因子介導髓核細胞功能的轉變得到了其他研究的支持。此外，類似于軟骨細胞，本課題組前期研究表明，椎間盤細胞的增殖和分化依賴于Notch信號通路〔4〕。血府逐瘀湯是一種中醫處方劑名，由各種中草藥及果實種仁按照一定的比例配合而成，具有一定的活血化瘀，行氣止痛作用。骨形態發生蛋白(BMP)9是轉化生長因子(TGF)-β超家族的成員，它是一種強生長分化因子，最初是從生長小鼠的肝臟中分離出來的〔5〕。它在間充質干細胞的軟骨形成分化的促進運動中起重要作用。髓核和軟骨中ECM的主要成分相似，其本質是聚集蛋白聚糖和Col2a1。本文主要探討血府逐瘀湯通過影響BMP9表達抑制Notch信號通路調節髓核細胞增殖的機制。

1 資料與方法

1.1實驗動物 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，6～8周齡，體重190～220 g，各實驗大鼠置于相同的環境中，12/12 h黑暗循環，并將大鼠在溫控(22±2)℃的房屋中飼養。實驗程序均經動物保護和使用委員會批準，并根據實驗動物護理和使用指南進行實驗。

1.2建立腰椎間盤組織模型并分組 隨機分為3組，對照組12只，其他24只。通過腹膜內注射10%水合氯醛給大鼠施用麻醉(3 ml/kg)。將大鼠麻醉，置于具有固定肢體的俯臥位。使用脫毛劑制備背部皮膚上4 cm×8 cm的區域。然后將滅菌的覆蓋片放在大鼠上，沿著后腰的棘突切割中線切口。切割皮膚后，進行骨膜下剝離以充分暴露棘突，關節突和椎板。咬骨鉗用于去除棘突，關節突，棘上韌帶和棘突間韌帶。雙側豎脊肌切開。然后將皮下筋膜和皮膚逐層縫合回來。給藥方法：動物模型建立后，將其中12只大鼠腹腔注射50 mg/kg血府逐瘀湯。6 w后，再次對標記的大鼠進行磁共振成像(MRI)檢查，然后處死所有大鼠。收集腰椎間盤組織將一個片段中間固定在2%戊二醛中，將另外兩個片段保存在-20 ℃。

1.3實驗方法

1.3.1髓核原代細胞培養及BMP9轉染 使用的腺病毒包括攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒(Ad-GFP)，腺病毒介導的BMPq(Ad-BMP)9和Ad-BMP9抑制劑，髓核 P0傳代通過使用0.25%胰蛋白酶消化(NPC)，傳代，并返回培養箱4 h。此時大多數細胞黏附在板上。添加Polybrene和不同組的腺病毒(MOI值100)，并且感染效率保持在50%。使其髓核細胞進行BMP9超表達與抑制表達，感染后6～8 h更換培養基，在感染24 h后進行后續實驗。

1.3.2蛋白印記分析 將椎間盤組織在RIPA裂解緩沖液中于4 ℃勻漿5 min，得到10%勻漿。RIPA緩沖液中于4 ℃裂解45 min，離心(10 000 r/min，4 ℃，5 min)并收集上清液用于下一個實驗。根據制造商的方案，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白質測定試劑盒測量總蛋白質濃度。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質樣品并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。將膜在含有5%脫脂奶粉的tris緩沖鹽水和吐溫20(TBST)中封閉1.5 h。用TBST洗滌膜，然后與相應的辣根過氧化物酶(HRP)-綴合的第二抗體(1∶5 000)在室溫下孵育1.5 h。再次洗滌膜后，用增強的電化學發光(ECL)試劑觀察結合的抗體，并使用Quantity One軟件通過光密度分析進行定量。GAPDH的檢測用作對照。

1.3.3免疫熒光和髓核細胞鑒定 將原代髓核細胞消化，重懸于培養基中，以5×104個細胞/孔接種于24孔板中的無菌細胞載玻片上，并培養24 h。用PBS洗滌細胞，并使用4%多聚甲醛在室溫下將細胞固定20 min。用PBS洗滌細胞3次，并且每次加入0.5%Triton 10 min。用PBS洗滌細胞，并使用山羊血清阻斷非特異性結合1 h。血清被完全吸入，并將細胞與第一抗體(兔抗Col2a1或小鼠抗聚集蛋白聚糖在4 ℃過夜孵育。將板在室溫下放置1 h并用PBS洗滌。在避免光照的同時進行后續步驟。將第二抗體(山羊抗兔，紅色熒光；山羊抗小鼠，綠色熒光)溫育1 h。用PBS洗滌細胞，并用4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)將細胞核染色10 min。用PBS洗滌載玻片，轉移到載玻片上，用甘油密封后用熒光顯微鏡拍照。在隨后的實驗中通過使用具有紅色熒光的二抗進行免疫熒光檢測髓核細胞中ECM的表達。

1.3.4RNA提取和半定量RNA分析 通過使用GeneJET RNA純化試劑盒收集每組具有腺病毒感染的髓核細胞用于RNA提取。通過使用分光光度計測量RNA濃度。通過使用逆轉錄和反轉錄第一鏈cDNA合成試劑盒。使用以下反應條件：在25 ℃下放置5 min，然后在42 ℃下放置60 min。通過在70 ℃加熱5 min終止反應。使用以下反應條件：在95 ℃下初始變性2 min，進行1個循環；在95 ℃變性30 s，在55 ℃退火30 s，在72 ℃延伸1 min；最后在72 ℃延伸5 min。使用1.5%瓊脂糖凝膠在80 V下進行凝膠電泳35 min。RT-PCR引物序列：Notch1：上游引物：AGGGCTTCCATTGTATTGAGGT、下游引物：ATCATCTTGGCATCCCTCTTG；DLL1：上游引物：ACCACAGTCCATGCCATCCACT、下游引物：GTATATTTGGGACCCCGTAGA；BMP9：上游引物：ACGATCTGTTTCCCCTCATCT、下游引物：ATGCAGGGATGATGTTCTG；GAPDH：上游引物：CGACAACTTTGGCATTGTGG、下游引物：TAAGTCGATCCCTAGTGACAA。

1.3.5CCK8檢測髓核細胞增殖 使用CCK8測定法檢測BMP9對髓核細胞的增殖影響。除特異性結構外，所有實驗使用Ad-GFP作為對照組，并遵循前面提到的感染方法，并比較Ad-GFP和Ad-BMP9感染的細胞。將細胞接種于96孔板中。1×104細胞/孔，每組使用3個重復。在細胞感染后24 h加入CCK8試劑(10 ml)，并將平板放回培養箱中2 h。通過自動微板讀數器在450 nm下測量吸光度。

1.3.6TUNEL分析髓核細胞的凋亡率 根據制造商的說明，使用ApopTag過氧化物酶原位凋亡檢測試劑盒評估細胞凋亡。簡言之，從在室溫下用10 U/ml DNase Ⅰ處理20 min的正常細胞陽性對照樣品。將切片用3.0%H2O2預處理，與末端脫氧核苷酸轉移酶在37 ℃反應1 h，然后與地高辛配基的核苷酸底物在37 ℃溫育30 min。在3,3-二氨基聯苯胺(DAB)中孵育5 min后，表現出DNA片段化的細胞核變為深棕色。將組織切片用蘇木素復染，固定，并通過光學顯微鏡觀察。

1.4統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1各組BMP9 mRNA的相對表達 誘導模型組BMP9 mRNA表達較對照組明顯降低(1.15±0.22、3.26±0.18，P<0.05)。而血府逐瘀湯組BMP9 mRNA表達(2.88±0.31)較誘導模型組明顯升高(P<0.05)。

2.2CCK8檢測髓核細胞的增殖 模型誘導組髓核細胞的含量明顯低于對照組、血府逐瘀湯組〔41.4±2.47)、(82.35±1.52)、(73.52±3.23)，P<0.05〕。見圖1。

圖1 CCK8檢測(×100)

2.3BMP9促進髓核細胞中的ECM表達 模型誘導組聚蛋白多糖(Aggrecan)和Col2a1蛋白表達明顯低于對照組(P<0.05)，血府逐瘀湯組Aggrecan和Col2a1蛋白表達明顯高于模型誘導組(P<0.05)。見表1。

表1 各組Aggrecan和Col2a1蛋白表達比較

2.4BMP9對Notch信號配體mRNA表達的影響 通過RT-qPCR檢測Notch信號傳導途徑中BMP9對Notch1和DLL1的mRNA表達的影響，細胞培養組和BMP9轉染組Notch1和DLL1 mRNA明顯低于BMP9抑制轉染組(P<0.05)。細胞培養組和BMP9轉染組BMP9 mRNA表達明顯高于BMP9抑制轉染組(均P<0.05)。見表2，圖2。

2.5TUNEL分析 BMP9抑制轉染組較對細胞培養組、BMP9轉染組細胞凋亡率明顯升高，細胞活力明顯下降(均P<0.05)。見表3。

圖2 BMP9、Notch1和DLL1的mRNA檢測

表2 各組BMP9、Notch1和DLL1 mRNA表達情況

表3 各組髓核細胞的凋亡率、細胞活力測定

3 討 論

背痛是肌肉骨骼殘疾的主要原因，雖然確切原因尚不完全清楚，但椎間盤退變被廣泛接受為主要原因〔6〕。目前，沒有有效的疾病改善療法可用于背痛，主要是由于我們對椎間盤穩態和變性的分子機制的有限理解。椎間盤退變是一種特殊的纖維軟骨組織，由髓核纖維環，軟骨終板和生長板軟骨組成〔7〕。Notch信號傳導是一種進化上保守的途徑，在多種組織的發育和穩態中起重要作用，而其失調涉及多種疾病。隨著衰老和變性，髓核細胞經歷表型轉化并被分泌非典型纖維細胞外基質的成纖維細胞所取代〔8,9〕。這表明細胞微環境的變化和分解代謝介質的存在可能促進異常增殖和分化。細胞因子介導髓核細胞功能的轉變得到了其他研究的支持〔10〕。此外，類似于軟骨細胞，有研究表明，椎間盤細胞的增殖和分化依賴于Notch信號通路。Notch信號傳導主要由Notch受體(哺乳動物中的Notch1-4)通過其配體(包括哺乳動物中的DLL1的結合觸發，兩者都在兩個相對細胞的表面上表達〔11,12〕。 Notch受體-配體結合激活Notch受體的兩個連續酶促切割，其將其細胞內結構域(NICD)釋放到細胞質中〔13〕。生理Notch信號傳導是維持關節軟骨所必需的，而Notch信號傳導的持續激活導致軟骨退化和骨關節炎〔14〕。

據報道Notch信號通路的所有成分，即受體，配體和靶基因，都在椎間盤細胞中表達〔15〕。本研究表明，Notch信號傳導對維持椎間盤缺氧灶中髓核細胞增殖至關重要。BMP9是一種強生長分化因子，在間充質干細胞的軟骨形成分化運動中起重要作用〔16,17〕。之前的報道稱髓核和軟骨中ECM的主要成分相似，其本質是聚集蛋白聚糖和Col2a1〔18,19〕。本研究結果說明較椎間盤退變組大鼠升高，這表明誘導模型組ECM表達下降，對髓核細胞的生長具有不利因素。通過血府逐瘀湯的藥物處理后，給藥組大鼠中Col2a1蛋白表達升高，對髓核細胞的增殖具有一定的促進作用。研究表明Notch信號通過調節軟骨基質中的合成代謝和分解代謝分子在關節維持和骨關節炎中發揮雙重作用〔20〕。

本研究結果證實證明血府逐瘀湯可促進BMP9表達，而轉染高表達的BMP9髓核細胞抑制Notch1和DLL1在髓核細胞的生物功能，促進了髓核細胞的增殖，為椎間盤退變疾病的治療提供了可能有效的方法，BMP9通過抑制Notch信號通路中的Notch1和DLL1從而干擾髓核細胞的增殖發育，其中血府逐瘀湯可促進誘導模型組中BMP9的表達，進而促進髓核細胞的增殖。