氨來呫諾引起腎性尿崩癥的機制

劉云濤 江攀 潘敬芳 張琦 張軍

(1三峽大學附屬仁和醫院內分泌科，湖北 宜昌 443000；2重慶醫科大學附屬第三醫院心內科；3宣昌市夷陵醫院內分泌科)

氨來呫諾(ALX)具有抗炎和抗過敏的作用，目前主要用來治療復發性口腔潰瘍與哮喘等〔1，2〕。動物實驗發現ALX可以通過抑制核因子κB抑制物激酶(IKK)ε和Tank結合激酶(TBK)1途徑來治療肥胖、2型糖尿病，可以提高脂肪組織的能量消耗，減輕體重，改善胰島素敏感性和減少脂肪組織的慢性炎癥因子〔3〕，但是其副作用尚未認識，尚未見口服用于臨床的報道。我們前期實驗發現ALX導致大鼠尿量增多，因此我們探討ALX誘導腎性尿崩癥的(CNDI)機制，這對今后ALX用于臨床代謝性疾病治療是一個警示。同時，如果IKKε參與CNDI的發生，這將是一個良好治療CNDI的靶基因，為今后的IKK-ε激動劑治療CNDI提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗材料 IKKε、水通道蛋白(AQP)2引物、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)引物由武漢博士德生物工程有限公司設計合成。一抗、二抗分別購自武漢三鷹生物技術有限公司、武漢博士德生物工程有限公司。逆轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司。大鼠精氨酸加壓素(AVP)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1模型建立與分組 隨機選取野生型大鼠(WT)組10只，IKKε基因敲除大鼠(KL)組10只，體重200～220 g。實驗大鼠均購自上海南方模式生物科技有限公司，給予普通飼料，喂養于代謝籠單籠、單養，自由飲水和進食，記錄尿量和飲水量。稀釋后的尿液加入電解質標液Ⅰ，搖勻后進行尿離子含量檢測。

1.2.2實驗干預 將WT組和KL組大鼠每2只一組，分別給予ALX(購自Cayman chemical公司)20、40、60、80、100 mg/kg灌胃，在ALX灌胃時給予去氨加壓素(dDAVP，深圳翰宇藥業股份有限公司)1 μg/kg皮下注射〔4〕。于尿量增多24 h后禁水12 h后觀察24 h尿量變化。

1.2.3逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測IKKε、AQP2 mRNA 核酸蛋白測定儀測定兩組大鼠腎臟髓質AQP2 mRNA、WT組IKKε mRNA，取-80℃冰箱中保存的新鮮冰凍腎髓質，重量約為100 mg，按照Trizol一步法提取RNA，測定RNA濃度和純度。取等量RNA逆轉錄得到互補脫氧核糖核酸(cDNA)。取適量cDNA進行擴增。引物序列：IKKε上游引物5′-TGTACAAGGCCCGGAATAAG-3′，下游引物5′-CCTCCACTGCGAATAGCTTC-3′。AQP2上游引物：5′-TAGCCTTCTCCCGAGCAGTG-3′，下游引物5′-GCGGAGACGAGCACTTTGACA-3′。

1.2.4Western印跡測定IKKε、AQP2蛋白水平 KL組大鼠腎臟髓質提取AQP2蛋白，WT組大鼠腎臟髓質提取IKKε、AQP2蛋白，用β-actin作為內部對照。用增強化學發光(ECL)檢測系統顯示辣根過氧化物酶(HRP)耦聯抗體產生的信號，在柯達X膠片上曝光。用Bandscan4.3軟件進行密度分析，確定蛋白質水平作為頻帶強度的集成區域(像素)。

1.3統計學方法 采用 SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1ALX誘導CNDI的劑量 ALX 20、40 mg/kg灌胃并不能明顯增加大鼠飲水量、尿量和AVP水平(P>0.05)，ALX 60、80、100 mg/kg灌胃后較灌胃前兩組大鼠飲水量、尿量、AVP水平明顯增加(P<0.01,P<0.05);尿比重顯著降低(P<0.01)，ALX 80、100 mg/kg灌胃與ALX 60 mg/kg灌胃相比較，大鼠尿量、飲水量、尿比重、AVP無顯著差異(P>0.05)。見表1。ALX 60 mg/kg灌胃后較灌胃前兩組大鼠尿離子含量明顯減少(P<0.01)。見表2。

表1 不同劑量ALX灌胃前后WT及KL組大鼠飲水量、尿量、尿比重、AVP水平比較

表2 ALX 60 mg/kg灌胃對尿離子的影響

2.2ALX導致多尿的時間依賴性 在ALX60 mg/kg灌胃同時給予1 d dDAVP皮下注射，注射后24 h和48 h發現兩組大鼠尿量及尿比重無明顯變化(P>0.05)。ALX導致多尿24 h后禁水12 h，尿量、尿比重沒有明顯改變(P>0.05)。ALX60 mg/kg灌胃誘導的兩組大鼠多尿和低比重尿可持續48 h，從72 h開始尿量逐漸減少，尿比重逐漸增加，至96 h尿量和尿比重接近正常，見表3。

表3 ALX 60 mg/kg灌胃后尿量和尿比重的時間依賴性變化及dDAVP、禁水實驗的影響

2.3ALX對腎髓質IKKε、AQP2表達的影響 WT組ALX 60 mg/kg灌胃后IKKε、AQP2的表達顯著降低(P<0.05)，KL組ALX灌胃后AQP2的表達顯著降低(P<0.05)。見表4，圖1，圖2。

表4 ALX 60 mg/kg灌胃對大鼠腎臟髓質IKKε、AQP2表達的影響

1～4:WT組灌胃前、WT組灌胃后、KL組灌胃前、KL組灌胃后圖1 兩組ALX灌胃前后AQP2蛋白表達

圖2 WT組ALX灌胃前后IKKε蛋白表達

3 討 論

CNDI是以血漿AVP水平正常或升高，但腎臟不能正常濃縮尿液為特征的疾病〔5〕。本研究結果說明ALX具有誘導CNDI發生的作用。ALX誘導CNDI有時間依賴性。

AQP2是腎臟集合管上的抗利尿激素(ADH)依賴性水通道，主要表達在集合管的主細胞上，選擇性地使水分子通過，并在AVP的調節下，于頂膜和儲存囊泡之間轉換位置，AQP2最重要的功能是介導水的跨膜運輸，在尿液濃縮中發揮了重要作用。已證實AQP2基因變異參與了CNDI的發生〔6〕。有研究發現給予大鼠高鋰飲食，可通過減少大鼠腎臟集合管AQP2表達減少，誘導CNDI發生〔4〕。研究還發現三苯氧胺可通過上調鋰劑誘導的CNDI大鼠集合管AQP2的表達，從而改善多尿癥狀〔7〕。有學者認為，激活AQP2可能是CNDI的治療策略〔8〕。這些提示調控AQP2的表達在CNDI的發生具有重要作用。本研究結果提示ALX可能通過對AQP2的影響誘導了CNDI的發生。目前關于藥物和其他化合物對AQP2的影響研究十分有限，除了發現鋰劑對AQP2的表達具有抑制作用之外，還發現某些對IKKβ具有抑制作用的藥物和化合物如氯硝柳胺、血清垂體中葉素(IMD)-0354對AQP2、AQP4具有抑制作用〔9，10〕。而IKKε與IKKβ同屬IKK家族，兩者具有類似的作用，并且在結構上具有高度相似性〔11〕。ALX是IKKε的特異性抑制劑，本研究進一步證實ALX對IKKε具有抑制作用。ALX誘導CNDI是否與IKKε有關，值得探討。本研究結果提示ALX誘導CNDI的發生與IKKε的表達降低無關。