去酰基化胃饑餓素對高脂飲食誘導C57BL/6J小鼠的抗疲勞作用

郭展宏 臧璞 郭青玉 楊翠華 邵加慶

(東部戰區總醫院內分泌科，江蘇 南京 210002)

近年來隨著飲食結構和生活節奏的改變，以肥胖為代表的代謝性疾病的發病率顯著上升。過量攝入脂肪會導致肥胖和胰島素抵抗，抑制骨骼肌蛋白質合成的上游信號傳導，引起肌肉質量減少〔1〕。衰老和骨骼肌脂肪堆積也被認為對骨骼肌質量具有顯著的負面影響〔2〕。動物研究發現高脂飲食(HFD)喂養的小鼠骨骼肌損傷后，后肢肌肉減少，肌纖維數量也隨之減少〔3〕。此外，HFD亦可引起骨骼肌線粒體功能受損，導致運動能力下降和肌肉易疲勞〔4〕。肥胖所致抗疲勞能力的下降對機體健康和生活質量均產生明顯負面影響。

胃饑餓素(Ghrelin)是胃底黏膜分泌的一種腦腸肽，在體內主要以去酰基化胃饑餓素(DAG)形式存在。Ghrelin可作用于體內諸多臟器并發揮廣泛生理作用。近年研究發現ghrelin酰基化形式(AG)可通過激活乙酰輔酶A羧化酶促進骨骼肌細胞脂肪酸氧化〔5〕，抑制肌肉萎縮，改善老年性肌無力，且能夠影響 運動耐力〔6，7〕。而DAG并不激活經典Ghrelin受體生長激素促泌劑受體(GHS-R)1a，對肌肉耐力的影響及機制尚不明確。本研究通過建立HFD誘導的小鼠肥胖模型，旨在探究DAG對肥胖小鼠抗疲勞能力的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 C57BL/6小鼠36只(SPF，雄性，6周齡，購自南京大學動物實驗中心)，飼養于屏障動物實驗設施內(環境溫度保持在22～24℃，相對濕度保持在50%～70%，12 h交替照明，自由進食水)，正式實驗前適應性喂養1 w。36只小鼠隨機平均分為3組：對照(NC)組、高脂(HFD)組、HFD+DAG組，每組12只。分別予以含10%脂肪和70%碳水化合物的標準飼料喂養(NC組)、含60%脂肪和20%碳水化合物的高脂飼料喂養(HFD組、HFD+DAG組)。三組小鼠分別給予每日腹腔注射生理鹽水10 ml/kg(NC組，HFD組)、DAG0.8 mg/kg(HFD+DAG組)。DAG購自加拿大AnaSpec公司，標準飼料(D12450J)及高脂飼料(D12492)均購自美國Research Diets公司。

1.2小鼠跑步運動耐力實驗 實驗動物喂養15 w時使用電動跑臺(ZH-PT型，安徽正華生物儀器設備有限公司)行力竭測試：所有小鼠連續3 d適應跑臺，持續時間為10 min，速度為10 m/min，跑臺傾斜10°。第4天時所有小鼠以初始速度10 m/min(10°坡度)在跑臺上跑步，以0.5 m/min的速度加速至最高25 m/min。直到因小鼠力竭而終止實驗，記錄下跑步距離代表小鼠運動能力。小鼠力竭標準：在運動過程中，電刺激頻率在4次/min以上，不能維持原強度運動，10 min短暫休息后，不能恢復運動能力且刺激驅趕無效，即判斷為力竭。

1.3小鼠負重游泳實驗 所有小鼠在喂養16 w后行負重游泳試驗：稱量小鼠，在鼠尾根部負荷10%體重的鉛皮。隨后放置于水深30 cm，水溫25℃的水槽中，待小鼠沉入水底后將其及時撈出。記錄小鼠自游泳開始至沉入水底的時間，作為小鼠游泳力竭時間。完成負重游泳試驗后即處死小鼠，取出單側腓腸肌及股四頭肌并稱重，計算腓腸肌或股四頭肌指數=腓腸肌質量或股四頭肌質量(g)/體重(g)。取血分離血清，檢測小鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)、乳酸(LA)、尿素氮(BUN)、肝糖原、肌糖原水平。LDH活性檢測試劑盒(BC0680)、LA含量檢測試劑盒(BC2235)、BUN含量檢測試劑盒(BC1535)、糖原含量檢測試劑盒(BC0345)均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4統計學分析 應用SPSS23.0軟件進行正態性及方差齊性檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組小鼠體重與主要肌肉指數變化 實驗于給藥16 w后結束，實驗期間各組小鼠體重均呈增長趨勢見表1。自給藥第2周開始，HFD組小鼠體重明顯高于NC組(P<0.05)。與HFD組相比，HFD+DAG組小鼠體重未見明顯差異(P>0.05)。給藥16 w后，HFD組腓腸肌及股四頭肌指數較NC組顯著下降(P<0.05)；與HFD組相比，HFD+DAG組小鼠腓腸肌及股四頭肌指數無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表1 各組不同時間小鼠體重比較

表2 各組腓腸肌及股四頭肌指數比較

2.2各組跑臺力竭運動距離與游泳力竭時間比較 與NC組相比，HFD組運動距離及游泳力竭時間明顯縮短(P<0.01)；與HFD組相比，HFD+DAG組運動距離及游泳力竭時間顯著延長(P<0.05)。見表3。

2.3各組BUN、LDH及LA水平比較 與NC組相比，HFD組血清BUN、LA顯著升高，LDH顯著下降(P<0.01)；與HFD組相比，HFD+DAG組BUN、LA均明顯下降，LDH明顯升高(P<0.05)。見表4。

表3 各組跑臺力竭運動距離及游泳力竭時間比較

表4 各組血清生化指標比較

2.4各組肝糖原和肌糖原水平比較 與NC組相比，HFD組肝糖原和肌糖原含量均明顯下降(P<0.01)；與HFD組相比，HFD+DAG組肝糖原和肌糖原含量均明顯升高(P<0.01)。見表5。

表5 各組肝糖原和肌糖原水平比較

3 討 論

研究表明肥胖可導致骨骼肌細胞線粒體功能受損、運動耐力下降〔8〕。運動耐力是對機體疲勞程度最客觀直接的反映，在動物實驗中電動跑臺力竭測試和負重游泳試驗是反映實驗動物運動耐力和測試藥物抗疲勞效果的有效手段〔9，10〕。本研究利用上述方法評估小鼠運動耐力發現相比NC組，HFD組小鼠體重顯著上升，運動耐力明顯降低，與既往研究一致〔11〕。

近年研究發現，Ghrelin可促進骨骼肌再生和衛星細胞自我更新，同時抑制骨骼肌活性氧自由基產生和炎癥反應〔12〕。Mani等〔6〕發現運動引起的血漿總Ghrelin水平的增加與耐力呈正相關；與野生型同窩小鼠相比，Ghrelin受體基因敲除小鼠的力竭時間明顯縮短。本研究顯示長期應用DAG可明顯增加肥胖小鼠的跑臺力竭運動距離并延長游泳力竭時間，表明DAG對肥胖小鼠具有顯著的抗疲勞作用。上述作用可能與DAG干預肌肉代謝有關，有研究發現DAG可通過激活肌管中的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Kβ)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體(mTORC)2及p38信號通路，抑制地塞米松誘導的骨骼肌萎縮〔13〕。此外，在Ghrelin受體基因敲除(Ghsr-/-)的小鼠中，DAG可誘導骨骼肌中絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)的磷酸化，改善禁食引起的肌萎縮〔13〕。由于DAG不能激活GHSR-1a，因而其抗疲勞作用發揮可能并不依賴于GHSR-1a受體途徑，具體機制有待進一步探索。

在劇烈運動過程中，肌肉組織的主要供能方式由有氧氧化轉變為無氧酵解，肌糖原被快速消耗并產生大量LA，并影響Ca2+的釋放，從而抑制肌肉收縮能力并導致疲勞〔14〕。LDH可將LA中的氫解離重新還原成丙酮酸，從而緩解LA堆積。因此，小鼠運動能力與乳酸含量呈反比，而與LDH呈正比。本研究結果表明DAG干預可防止LA堆積并加速LA清除，同時升高LDH水平，發揮抗疲勞作用。BUN是蛋白質和氨基酸代謝的主要產物。隨著運動強度和時間的增加，碳水化合物和脂肪所產生的能量不足以滿足機體需求，隨后蛋白質和氨基酸被分解供能導致BUN升高。BUN水平一定程度反映了機體疲勞狀態。本研究表明DAG干預組小鼠血清BUN水平明顯降低，疲勞狀態得到緩解。

血糖、肝糖原和肌糖原是體內三大糖儲備。長時間劇烈運動消耗血糖，糖原將成為重要供能物質。研究發現，肌糖原含量的增加可明顯改善小鼠運動能力〔15〕。糖原含量亦可作為反映機體運動耐力的重要指標〔16〕。本研究結果表明DAG干預亦可通過增加機體糖原儲備，提高運動耐力。

綜上所述，應用DAG有助于提高肥胖小鼠的運動耐力和抗疲勞能力。同時，有研究顯示DAG亦能夠降低肥胖機體本身胰島素抵抗及炎癥狀態〔12〕。本研究結果為提高肥胖患者運動效果與生活質量等提供了新的思路，然而DAG抗疲勞相關作用機制目前尚不明確，仍有待進一步研究。