橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠神經元凋亡及JNK/p38 MAPK信號通路的影響

徐祖清 王詩洋 王梟 劉悅 金華

(1深圳市龍華區中心醫院，廣東 深圳 518000；2延邊大學附屬醫院)

橄欖苦苷(oleuropein)為環烯醚類葡萄糖苷，廣泛存在于木犀科植物中，在油橄欖葉中含量尤為豐富，具有器官保護、降血脂、降血壓、降血糖、解毒、抗氧化、抗炎及抗腫瘤等多種藥理作用〔1～3〕。近年來，橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷的保護作用逐漸引起了人們的關注。橄欖苦苷對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有保護作用，該作用與抑制炎性反應有關〔4〕。此外，橄欖苦苷對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用與減少自由基損傷及抗氧化作用有關〔5〕。本實驗在進一步驗證橄欖苦苷在保護大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷作用的基礎上，著重研究該作用與神經元凋亡及c-Jun氨基末端激酶(JNK)/促分裂素原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號通路的關系，初步闡明作用機制，從而為其臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1動物 清潔級Sprague Dawley(SD)大鼠70只，雄性，體重200～220 g，購自上海西普爾必凱公司。

1.2試劑 橄欖苦苷購于上海滬震公司，純度>95%；尼莫地平片為德國拜耳公司產品，規格為30 mg/片；2，5，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)由美國Sigma公司提供；實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)測定試劑盒，大連寶生物公司。JNK、磷酸化(p)-JNK、p38及p-p38多克隆抗體，美國 Santa Cruz公司。

1.3儀器 MS-TS型分析天平，梅特勒-托利多(上海)公司；600-BS-Ⅱ型電熱恒溫干燥箱，上海躍進醫療器械廠；QuantstudioTMDX型定量PCR儀，美國ABI公司；Mini-3型垂直式蛋白電泳儀，美國 Bio-Rad公司。

1.4方法

1.4.1分組、給藥及腦缺血再灌注損傷大鼠模型建立 SD大鼠按體重隨機分為5組，即假手術組、模型組、尼莫地平組(0.5 mg/kg)及橄欖苦苷高、低劑量組(40、20 mg/kg)，每組14只。連續灌胃給藥14 d，1次/d；末次給藥結束后1 h，將麻醉后的大鼠固定于手術臺。在頸部正中位置處切口，暴露頸內動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)和左側頸總動脈(CCA)，將ECA結扎使ECA主干一段游離。將CCA遠心端結扎，近心端用動脈夾夾閉。剪一小口于ECA上，通過ECA將尼龍線栓插入ICA，緩慢推進約1 cm到達腦前動脈(ACA)處。進行2 h腦缺血后，將線栓抽出行再灌注24 h。假手術組無須插入尼龍線，其余步驟同上。

1.4.2神經癥狀評分測定 參照Bederson法〔6〕開展神經癥狀評分的測定。意識喪失或不能自發行走為3分；行走時向右側傾倒或向右側旋轉為2分；不能完全伸直右前肢為1分；神經癥狀正常為0分。

1.4.3腦梗死面積測定 各組均取SD大鼠7只，在冰上迅速斷頭取腦，去除低位腦干、小腦和嗅球，由前向后行連續冠狀切片，在37℃下用2%TTC溶液避光染色30 min。染色后腦梗死組織呈白色，正常組織呈玫瑰紅色，利用計算機圖像分析軟件測定腦梗死面積。

1.4.4大腦組織含水量測定 各組剩余SD大鼠，在冰上迅速斷頭取腦，將大鼠兩側大腦半球切開，左右各取兩側基底節區和皮層區兩個部位的腦組織200 mg，精密稱量濕質量。在100℃烘箱中放置72 h，精密稱量干質量，計算腦組織含水量。

1.4.5半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2及Bcl-2相關x蛋白(Bax) mRNA表達測定 分離缺血側頂葉大腦皮質約100 mg，Trizol法提取總RNA，并逆轉錄為cDNA，實時定量qPCR所需引物由南京金斯瑞生物公司合成。Caspase-3引物序列為上游：5′-AGCTTCTTCAGAGGCGACTA-3′，下 游：5′-GGACACAATACACGGGATCT-3′；Bcl-2引物序列為上游：5′-GGTACCGGAGAGCGTTCAGT-3′，下 游：5′-CTGCTGCATTGTTCCCGTAG-3′；Bax引物序列為上游：5′-CGAGTGGTCTCCGGCGAATTG-3′，下 游：5′-ATGGTGAGCGAGGCGGTGAG-3′；內參β-actin 引物序列為上游：5′-CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC-3′，下 游：5′-CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG-3′。實時定量qPCR反應體系及擴增條件，嚴格按照試劑盒說明書進行，通過2-ΔΔCt值計算各組mRNA相對表達水平。

1.4.6JNK/p38 MAPK信號通路蛋白表達測定 分離缺血側頂葉大腦皮質約100 mg，液氮中研磨后加預冷的組織裂解液，裂解30 min，離心(12 000 r/min，10 min)，保留上清液。BCA法對蛋白含量進行測定，煮沸變性后，加上樣緩沖液。經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白并轉至聚偏二氟乙烯膜上；脫脂奶粉封閉后，分別加入JNK、p-JNK、p38及p-p38多克隆抗體，結合后再加入相應的二抗。顯色、曝光后，拍照，分析各條帶光密度值，計算各組目的蛋白相對表達量。

1.5數據處理與統計 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠神經癥狀評分的影響 假手術組大鼠神經癥狀正常，與假手術組比較，模型組大鼠神經癥狀評分顯著增加〔(0.00±0.00)分 vs (2.55±0.34)分；P<0.05〕，表明大鼠腦缺血再灌注損傷模型建立成功。與模型組比較，尼莫地平及橄欖苦苷高、低劑量組大鼠神經癥狀評分均顯著降低〔(1.32±0.17)分、(1.56±0.21)分、(1.81±0.18)分；P<0.05〕。

2.2橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積的影響 假手術組大鼠未出現腦梗死，而模型組大鼠有明顯的腦梗死發生，與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死面積顯著增加(P<0.05)，進一步提示大鼠腦缺血再灌注損傷模型建立成功。與模型組比較，尼莫地平及橄欖苦苷高、低劑量組腦梗死面積均顯著降低(P<0.05)。見圖1及表1。

圖1 橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積的影響

2.3橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織含水量的影響 與假手術組比較，模型組腦組織含水量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平及橄欖苦苷高、低劑量組腦組織含水量均有不同程度的降低，其中尼莫地平及橄欖苦苷高劑量組降低幅度顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組腦梗死面積及腦組織含水量比較

2.4橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織Caspase-3、Bcl-2及Bax mRNA表達的影響 與假手術組比較，模型組腦組織Caspase-3及Bax mRNA表達顯著增加(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA表達顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平及橄欖苦苷高、低劑量組腦組織Caspase-3及Bax mRNA表達明顯降低(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA表達明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達的影響

2.5橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠JNK/p38 MAPK信號通路的影響 假手術組p-JNK及p-p38蛋白低水平表達，與假手術組比較，模型組p-JNK及p-p38蛋白表達顯著增加(P<0.05)，提示模型組大鼠JNK/p38 MAPK信號通路處于活化狀態；與模型組比較，尼莫地平及橄欖苦苷高、低劑量組p-JNK及p-p38蛋白均顯著降低(P<0.05)，見圖2、表3。

1～5:假手術組、模型組、尼莫地平組、橄欖苦苷高劑量組、橄欖苦苷低劑量組圖2 橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠JNK/p38 MAPK信號通路的影響

表3 橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠JNK/p38 MAPK信號通路的影響

3 討 論

腦血管疾病以高發病率、 高死亡率、高致殘率及高復發率為特點，為中老年人的常見疾病，是導致人類死亡的三大疾病之一〔7〕。腦血管疾病以腦卒中為主，其中80%患者為缺血性腦卒中，且該病近年來呈顯著上升趨勢，嚴重影響著人們的生活水平和生活質量〔8〕。腦缺血再灌注損傷是指血流再灌注后，進一步加重缺血性損傷的現象，而緩解此過程具有重要意義〔9〕。本研究結果表明橄欖苦苷具有保護腦缺血再灌注損傷的作用。

腦缺血再灌注損傷機制涉及細胞凋亡、炎癥反應、氧化應激、能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性等，是一個復雜的病理過程，其中腦組織內神經細胞凋亡是導致再灌注損傷的重要機制之一〔10〕。研究發現〔11〕，發生腦缺血再灌注損傷時，凋亡細胞大量出現并伴隨著損傷的加重呈逐漸增多趨勢。Caspase家族與Bcl-2家族基因共同參與了由線粒體介導的細胞 “內源性途徑”凋亡過程。Caspase家族是細胞凋亡過程中重要的蛋白酶，其中Caspase-3在凋亡進行中扮演核心角色，抑制Caspase-3的表達對改善腦神經功能及降低腦血再灌注損傷具有積極的意義〔12〕。Bcl-2家族包括抗凋亡基因和促凋亡基因兩大類，在腦缺血再灌注損傷中，抗凋亡基因Bcl-2被抑制，促凋亡基因Bax被活化，均有利于誘導缺血性神經細胞發生凋亡〔13，14〕。本研究結果表明橄欖苦苷具有抑制腦缺血再灌注損傷大鼠神經元凋亡作用。相關研究表明〔15〕，在腦缺血再灌注損傷中，MAPK信號通路尤為關鍵。近年來的研究也證實〔16〕，MAPK信號通路的相關蛋白JNK和 p38幾乎參與了缺血性腦損傷的全部生理、病理過程，因而JNK/P38 MAPK信號通路在腦缺血再灌注損傷中的作用至關重要。JNK/p38 MAPK信號通路的活化，有助于神經元凋亡的發生，而阻斷該信號通路，對緩解腦缺血再灌注損傷具有重要意義〔17〕。研究發現〔18〕，抑制JNK/p38 MAPK信號通路中JNK 和p38的磷酸化并降低p-JNK、p-p38蛋白含量，是全反式維A酸保護大鼠腦缺血再灌注損傷作用的主要機制。沒食子酸丙酯對腦缺血再灌注模型大鼠神經元損傷的保護作用也與抑制JNK/p38 MAPK信號通路的激活有關〔19〕。本研究結果表明橄欖苦苷具有抑制腦缺血再灌注損傷大鼠JNK/p38 MAPK信號通路活化的作用。

綜上所述，橄欖苦苷對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，該作用與抑制JNK/p38 MAPK信號通路的活化進而減少神經元凋亡有關。