畢赤酵母分泌表達植物病毒蛋白制備自組裝納米催化劑提高催化性能

楊坤，盧曉雪，楊林松，趙慶歡，朱劼

（1 常州大學制藥與生命科學學院，江蘇常州213164；2 江蘇蘇州工業(yè)園區(qū)蘇州百拓技術服務有限公司，江蘇蘇州215123）

在納米尺度的受限空間（如納米籠和納米管）內進行催化反應，因存在限域效應而成為近年來學者研究的重點領域。與非限域的催化體系相比，它具有一些獨特的優(yōu)勢，如能抑制限域結構內納米顆粒遷移，保持納米粒子的高分散性和穩(wěn)定性、增加限域結構內反應物有效濃度等[1?4]。這些優(yōu)勢能顯著提高反應的催化性能。

目前，人們對化學合成納米尺度的限域體系展開了大量的研究，制備出包括沸石分子篩[5?7]、碳納米材料[8?10]、金屬有機框架材料[11?13]等限域結構，并將其作為納米反應器用于各類催化反應。除化學合成限域結構外，生物自身也會采用一些方式構建天然限域體系，如由蛋白質分子組成的超分子納米籠。而病毒樣顆粒（virus?like particles, VLPs）就是其中一類重要的蛋白納米籠，通常由病毒衣殼蛋白（CPs）自組裝形成。與化學合成的納米籠相比，VLPs 具有可再生、單分散、結構高度有序等優(yōu)點。近些年，除大量應用于病毒疫苗開發(fā)[14?15]、生物傳感[16?18]和載藥[19?20]外，VLPs 在催化領域的應用[21?22]也引起人們廣泛的興趣。它們通過自組裝將外源客體分子如聚合物、無機納米粒子和蛋白質封裝進中空的內部，構建功能化納米籠體系，允許小分子物質有選擇性進出腔體，從而實現(xiàn)一定的催化功能。這種對包裹納米顆粒的亞細胞結構仿生設計在催化領域潛力巨大。與源于動物病毒的VLPs 相比，源于植物病毒的VLPs 在生物安全方面具有明顯優(yōu)勢。因此，人們對一些植物病毒如豇豆褪綠斑駁病毒（CCMV）等的研究日益增多。天然CCMV衣殼是一個正二十面體結構（三角形剖分數(shù)T=3），其外徑28nm，內徑18nm，由180 個衣殼蛋白亞基組裝而成，每個亞基的分子量大小約為20000[16,23]。CCMV衣殼的一些獨特性能獲得了人們廣泛的研究興趣，包括對pH 和金屬離子雙重環(huán)境響應的體外自組裝和分解能力[24?25]。在重組過程中，金屬納米顆粒通過與蛋白籠內表面功能基團的相互作用，可以改變金屬納米粒子的電子結構，從而影響催化劑的催化活性和穩(wěn)定性。這一特性使CCMV VLPs 成為材料科學和仿生催化領域的多功能研發(fā)平臺[26?29]。

目前，CCMV 衣殼蛋白（CCMV CPs）可以通過感染植物宿主細胞擴增，或通過異源表達系統(tǒng)發(fā)酵獲取。通過感染宿主細胞的方式收獲天然病毒需較長的培養(yǎng)時間，且分離純化過程繁瑣，因此收率較低。為解決這一問題，一些異源表達系統(tǒng)，包括原核細胞表達系統(tǒng)（如大腸桿菌，Escherichia coli）和真核細胞表達系統(tǒng)（如巴斯德畢赤酵母，Pichia pastoris）被開發(fā)用于合成衣殼蛋白。其中，酵母系統(tǒng)在異源蛋白表達方面具有較強的吸引力[30?34]。這是由于酵母系統(tǒng)除了具有和原核表達系統(tǒng)相似的優(yōu)點（如基因操作簡便、成本低、生長快、蛋白質表達量大）之外，更重要的是，它還具有復雜的蛋白質翻譯后修飾能力，包括水解成熟、糖基化和二硫鍵形成[35]。這些特點有助于多肽鏈翻譯后的正確折疊而使其成為活性蛋白。而原核細胞由于缺少蛋白質翻譯后修飾能力而使其經(jīng)常產(chǎn)生大量不溶性包涵體[36?38]。另外，酵母表達系統(tǒng)還具備將外源蛋白分泌到胞外發(fā)酵液中的能力，這樣可以直接從發(fā)酵液中收集活性蛋白而不必破壞細胞，實現(xiàn)蛋白的連續(xù)生產(chǎn)，也方便了后續(xù)的純化過程，大大降低生產(chǎn)成本[38?41]。目前為止，CCMV CPs 已在多種酵母細胞中成功表達[31?32,42]，但多屬細胞內表達，依然需要細胞破碎、密度梯度離心等較復雜的純化過程。

為解決這一問題，本研究構建了一株基于Pichia pastoris（P.pastoris）的基因工程菌，用于分泌表達重組CCMV CPs，實現(xiàn)其在發(fā)酵上清液中的直接收獲。經(jīng)工藝優(yōu)化，CCMV CPs收率達101mg/L，純度超過90%。純化的衣殼蛋白進一步通過體外自組裝封裝Ru 納米顆粒，制備具有限域結構的復合納米催化劑Ru@VLPs，并以硝基芳烴還原為模型反應對其進行評價。這項研究為納米材料、仿生催化等新興產(chǎn)業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)VLPs 提供了一條簡便、綠色的途徑。

1 實驗部分

1.1 菌種、質粒、試劑和培養(yǎng)基

菌種和質粒：巴斯德畢赤酵母（P.pastoris）CN15349，BioTOP（中國蘇州）；含信號肽序列的質粒pPIC9K，Invitrogen（美國）。

試劑：Pfu?DNA 聚合酶，dNTP，T4 連接酶，限制性酶包括EcoR I，Avr II，SnaB I，Not I，Sac I，Sal I 和Bgl II，DNA 和 蛋 白 質Marker，F(xiàn)ermentas（加拿大）；磷酸酶，TaKaRa（中國大連）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒和凝膠回收試劑盒，Watson Biotechnologies（中國上海）；TIANamp酵母DNA試劑盒，Tiangen Biotech（中國北京）；G418抗生素，阿拉丁（中國上海）。

酵母膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）：20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸膏，20g/L葡萄糖（固態(tài)培養(yǎng)基加15g/L 瓊脂）。甘油緩沖復合培養(yǎng)基（BMGY）:10g/L 酵 母 浸 膏，20g/L 蛋 白 胨，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，100mL 10×YNB（無氨基酵母氮源）（13.4g/L），1mL 500×生物素（4×10?4g/L）和10mL甘油。甲醇緩沖復合培養(yǎng)基（BMMY）:10g/L酵母浸膏，20g/L 蛋白胨，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，100mL 10×YNB（13.4g/L），1mL 500×生物素（4×10?4g/L）和5mL甲醇。

1.2 基因工程菌構建

（1）CCMV CPs 基因構建 根據(jù)CCMV 的公開核苷酸序列（NCBI 登錄號AAA46373.1）[43]，全合成CCMV CPs 的基因序列。優(yōu)化后的CCMV CPs 基因序列設計如圖1所示。接著將構建的CCMV CP核苷酸序列克隆到pPIC9K 質粒的EcoR I（GAATTC）和Not I（GCGGCCGC）限制性位點之間用于蛋白表達。獲得的重組載體命名為pPIC9K?CP。

（2）重組菌株構建 首先采用電穿孔法將重組載體pPIC9K?CP 轉化到酵母菌株P. pastoris CN15349 感受態(tài)細胞；然后在YPD 培養(yǎng)基中，通過氨基糖苷類抗生素G418（1～6mg/mL）篩選獲得多拷貝重組子；接著針對CCMV CPs基因序列設計兩條引物：上游引物CPEcoRI?F（CATGCACCATC ATCACCACCATTCTACC） 和 下 游 引 物CPNotI?R（GGTGAAAGAGTCGTCGAAGGTTGGTCTAAC），用于聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，篩選陽性克隆；最后，篩選出重組蛋白表達菌株P. pastoris CN15349?CP。

1.3 酵母細胞分泌表達CCMV CPs

將P.pastoris CN15349?CP 菌 種 接 種 到100mL BMGY 培養(yǎng)基中，在250r/min、28℃下培養(yǎng)。當菌懸液在600nm 波長處的吸光度（OD600）達到2～6時，結束培養(yǎng)，將菌體從培養(yǎng)基中離心移出，重懸于100mL 液體BMMY 培養(yǎng)基中，于15～35℃、250r/min 培養(yǎng)24～144h，期間每24h 向培養(yǎng)基中添加終濃度體積分數(shù)0～2.0%的甲醇，誘導細胞分泌表達CCMV CPs。發(fā)酵結束后，離心收集發(fā)酵上清液，進一步純化蛋白。

1.4 CCMV CPs純化

陰離子交換層析純化:首先用5 倍柱體積的緩沖液（0.02mol/L Tris?HCl，0.1mol/L NaCl，pH 8.9）預平衡陰離子交換柱（BG32?3220?02，蘇州博進生物技術有限公司）；然后將發(fā)酵濃縮液裝柱吸附30min；接著用洗脫緩沖液（0.02mol/L Tris?HCl，1mol/L NaCl，pH 8.9）洗脫目標蛋白。洗脫液樣品用SDS?PAGE進行蛋白檢測。

圖1 經(jīng)密碼子優(yōu)化的CCMV CPs基因序列

將含有CCMV CPs的洗脫液置于透析袋（截留分子量8000，Spectrum Labs，美國）中，用10 倍體積的CCMV CPs 分解緩沖液（0.02mol/L Tris?HCl，0.9mol/L NaCl，0.001mol/L DTT，pH 7.4）在4℃下透析24h，每8h 更換一次透析緩沖液。純化的CCMV CPs保存在4℃下備用。

CCMV CPs 的分子量（Mw）和純度可用SDS?PAGE檢測分析，CCMV CPs的濃度可利用紫外?可見分光光度計（756S，上海冷光技術有限公司）測量其在280nm 波長下的吸收值，根據(jù)式(1)計算出CPs的濃度。

式中，A280為上清液中CCMV CPs 在280nm 波長下的吸收值；εcp為CCMV CPs 的消光系數(shù)，4.33×106L/(mol·cm)[16]；b 為光程長度（石英比色皿寬1cm）；c為CCMV CPs濃度。

1.5 CCMV VLPs的制備

CCMV CPs自組裝成病毒樣顆粒（VLPs）過程如下：將之前儲存于分解緩沖液中的CCMV CPs溶液置于透析袋（截留分子量8000，Spectrum Labs，美國）中，在4℃下用10 倍體積的重組緩沖液（0.1mol/L NaAc，0.9mol/L NaCl，0.01mol/L MgCl2，pH 4.8）透析24h。期間每8h 更換一次重組緩沖液。最終CCMV CPs 組裝為VLPs。其形貌和尺寸用透射電子顯微鏡（TEM）進行檢測。

1.6 釕納米顆粒（Ru NPs）的封裝

通過膠體法制備檸檬酸（CA）穩(wěn)定的Ru溶膠（Ru?CA）。以檸檬酸鈉為配體，KBH4為強還原劑，在室溫下將RuCl3直接還原生成穩(wěn)定的Ru 膠體溶液。實驗操作如下:首先將RuCl3水溶液（6mmol/L）與CA 水溶液（1.0%） 混合攪拌15min，保持n(CA)∶n(Ru)=11∶1；然后在劇烈攪拌下加入0.1mol/L KBH4還原Ru 納米顆粒，保持n(KBH4)∶n(Ru)=5∶1，反應5min，制備成Ru?CA溶膠。

Ru NPs在CCMV VLPs中的封裝操作步驟如下:將純化的CCMV CPs 分散液（0.4mg/mL）與Ru 膠體溶液（6mmol/L）充分混合30min，然后在4℃下用重組緩沖液透析過夜。封裝的Ru NPs 命名為Ru@VLPs，其形貌和尺寸利用透射電子顯微鏡（TEM）進行檢測。

1.7 Ru@VLPs在硝基芳烴還原反應中的催化性能

分別以4?硝基苯酚（4?NP）還原生成4?氨基苯酚（4?AP）以及3?硝基苯磺酸鈉（3?NBS）還原生成3?氨基苯磺酸鈉（3?ABS）為模型反應（圖2），評價復合納米催化劑Ru@VLPs 的催化性能，以檸檬酸穩(wěn)定的Ru 納米顆粒（Ru?CA）作為對照。

圖2 4?硝基苯酚和3?硝基苯磺酸鈉還原反應途徑圖

以4?NP加氫還原反應為例，反應體系：30μL 4?NP 水溶液（1mmol/L），20μL Ru@VLPs 水溶液（1.7μmol/L Ru），150μL KBH4（16mmol/L）。實驗在96 孔板中進行，反應溫度為25～40℃，反應時間15min。通過多功能酶標儀（Spark 10M，Tecan，瑞士）實時讀取反應體系在波長200～500nm 區(qū)間內的吸光度。已知底物4?NP、中間產(chǎn)物4?HP和終產(chǎn)物4?AP 分別在320nm、400nm 和296nm 的波長處具有最大吸收值。需要說明的是，4?NP 催化還原至中間產(chǎn)物4?羥胺苯酚（4?HP）的過程極短。因此，為簡化計算，4?NP 轉化率（Con）可通過反應過程中其在波長λ=400nm處4?HP吸光度的降低作為標準，如式(2)所示。

式中，Con為4?NP轉化率；t為反應時間。

對于不同催化劑上的反應活化能的計算，可由阿倫尼烏斯方程[式(4)]確定。

式中，k 為反應速率常數(shù)；Ea為活化能；T 為反應溫度；A 是頻率因子；R 為理想氣體常數(shù)，8.314J/(mol·K)。

1.8 催化劑回收循環(huán)實驗

以4?NP加氫反應用于催化劑的回收循環(huán)實驗，采用15mL的反應釜，反應體積5mL。在15mL反應釜中加入750μL 4?NP水溶液（1mmol/L）和500μL Ru@VLPs 水溶液（1.7μmol/L Ru），用水稀釋至5mL；接著，用H2置換釜內空氣6次，在30℃、常壓、鼓泡反應10min。

4?NP 加氫反應催化劑回收:催化劑重復利用4次，每次反應結束后，首先將反應液置于重組緩沖液（0.1mol/L NaAc， 0.9mol/L NaCl， 0.01mol/L MgCl2，pH 4.8）中透析24h，每8h換一次液，除去反應液中未反應的底物和產(chǎn)物，然后將透析液超濾濃縮，用于下一次反應。

2 結果與討論

2.1 CCMV CPs的分泌表達與純化

首先將CCMV CPs 基因序列克隆到pPIC9K 質粒。獲得的重組載體pPIC9K?CP 進一步轉化到P.pastoris CN15349 感受態(tài)細胞中，通過G418 濃度梯度（1～6mg/mL）篩選多拷貝重組子，結果如圖3所示。隨著G418濃度的增加，G418抗性菌落逐漸減少。當G418濃度達6mg/mL時，只在平板邊緣區(qū)域長出少許抗性菌落，表明多拷貝重組子的成功獲得。

圖3 YPD培養(yǎng)基中G418濃度梯度篩選高拷貝重組子(a)1mg/mL; (b)3mg/mL; (c)5mg/mL; (d)6mg/mL

接著，從含6mg/mL G418的YPD培養(yǎng)基上[圖3中樣品(d)]挑取8 個菌落，抽提質粒，通過PCR 擴增，篩選陽性克隆體。擴增后的核苷酸序列通過瓊脂糖凝膠電泳（AGE）檢測，如圖4所示。結果表明，從挑選的8個菌體中克隆出的目標基因，片段大小均約為600bp，與重組CCMV CPs（602bp）基因序列大小相似，證實了重組CCMV CPs基因成功整合進酵母細胞，可用于后續(xù)的分泌表達。

當負荷功率分別為2 MVA、4 MVA、6 MVA，功率因數(shù)為0.85，XC=0時，串補裝置處節(jié)點電壓分別為9.57 kV、8.89 kV、8.19 kV，若加入補償度k=2.25的補償電容時，補償點電壓分別提升1.272 kV、1.591 kV、1.668 kV。結果如圖4所示：容量與電流的平方成正比，而串聯(lián)電容器補償?shù)碾妷号c線路電流成正比。因此，當線路容量增大時，電流增大，補償?shù)碾妷阂搽S之增大。這就是串補的負荷自適應特性，也是其他無功補償均不具備的特性。

圖4 PCR篩選陽性克隆體

成功構建的P. pastoris CN15349?CP 分泌表達重組CCMV CPs包括高密度培養(yǎng)細胞和甲醇誘導分泌表達兩個階段。第一階段使用BMGY培養(yǎng)基，在28℃、250r/min 條件下培養(yǎng)8h。此時菌懸液在600nm 處的吸光度約為4，表明細胞密度已達到較高水平。接著離心收集細胞，用于第二階段的誘導表達。誘導表達結束后，離心收集發(fā)酵上清液用于后續(xù)純化。SDS?PAGE 結果如圖5（泳道1）所示。值得注意的是，泳道1中僅發(fā)現(xiàn)兩條蛋白條帶，分子量分別約22000 和15000。分子量約22000 的蛋白條帶對應于重組CCMV CPs，而分子量約15000的蛋白條帶很可能源自于培養(yǎng)基或細胞的代謝產(chǎn)物。電泳分析可知，發(fā)酵上清中分泌的CCMV CPs純度較高，達90%以上，大大簡化了后續(xù)的蛋白純化過程。

CCMV CPs的等電點經(jīng)計算約為9.3，與源于酵母細胞的其他蛋白質等電點（通常小于6.0）有一定的差異。因此，本文采用陰離子交換層析法進一步純化CCMV CPs。結果表明，在pH 為8.9 的洗脫液中，CCMV CPs 可以被進一步純化。如圖5（泳道2和泳道3）所示，源于宿主細胞的蛋白質在pH為8.9 時帶負電，因此大部分被吸附在陰離子交換柱上（泳道2）。然而，CCMV CPs 由于其此pH 環(huán)境中接近電中性而不被吸附，與平衡液一起流出層析柱（泳道3），從而得以純化。

圖5 陰離子交換柱純化CCMV CPs前后SDS?PAGE分析

2.2 蛋白誘導表達工藝條件的優(yōu)化

為提高CCMV衣殼蛋白的表達量，本文通過對誘導溫度，誘導劑甲醇濃度和誘導時間三個因素進行單因素和正交實驗，優(yōu)化表達條件。

首先通過單因素實驗確定三個因素的最佳條件范圍（圖6）。在研究溫度對蛋白表達的影響時，選擇5 個誘導溫度（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃），結果如圖6(a)所示。圖中可以看出，15～30℃溫度區(qū)間內，隨著溫度的升高，酵母細胞代謝加快，蛋白分泌量也隨之增加；當溫度達30℃時，發(fā)酵上清液中分泌的衣殼蛋白濃度最大，經(jīng)式(1)計算為(83.0±4.1)mg/L。因此，在較佳溫度30℃附近縮小范圍，選擇3 個點（27℃、30℃、33℃）用于正交實驗。

其次，在研究誘導劑甲醇濃度對蛋白表達影響時，選擇5 個甲醇終濃度（質量分數(shù)分別為0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%），如圖6(b)所示。結果表明，甲醇終濃度為0.9%時，發(fā)酵上清液中分泌的CPs 濃度達到最大(87.6±3.8)mg/L；甲醇終濃度為1.0% 和0.8% 時的CPs 濃度次之，分別為(83.4±4.5)mg/L 和(81.3±3.5)mg/L。經(jīng)統(tǒng)計分析，這兩組樣品沒有顯著性差異（p＜0.05）。因此，在較佳甲醇濃度0.9%附近選擇3個濃度用于正交實驗。然而，考慮到繼續(xù)縮小濃度差范圍，操作工藝上的誤差可能會增加。因此，本研究最終選用質量分數(shù)分別為0.8%、0.9%和1.0%3 個甲醇終濃度用于正交實驗。

圖6 P.pastoris CN15349?CP分泌表達重組CPs誘導條件的優(yōu)化

最后，在研究誘導時間對蛋白表達影響時，選擇5 個誘導時間（48h、72h、96h、120h、144h），如圖6(c)所示。結果表明，隨著誘導時間的延長，細胞不斷分泌蛋白。當細胞誘導培養(yǎng)96h后，發(fā)酵液中的CPs 的濃度達到較高水平[(95.1±4.8)mg/L]；而誘導時間繼續(xù)延長至120h，CCMV CPs 濃度為(97.5±3.3)mg/L，與96h相比，蛋白分泌量沒有明顯提高。因此，在較佳時間96h附近縮小范圍，選擇3個時間點（84h、96h、108h）用于正交實驗。

單因素確定最佳條件以后，設計三因素三水平（33）正交實驗，優(yōu)化誘導表達工藝。分別為：溫度（27℃、30℃、33℃）、誘導時間（84h、96h、108h） 和甲醇終濃度（質量分數(shù)0.8%、0.9%、1.0%）。

正交實驗結果如表1所示。結果表明，影響重組畢赤酵母表達CCMV CPs 的因素重要性依次為:誘導溫度＞誘導時間＞甲醇終濃度。可見，本研究中溫度的變化對畢赤酵母分泌蛋白影響最大。溫度不僅影響自身的代謝水平，同時也間接影響到細胞老化和細胞對甲醇的利用。本研究中，P. pastoris CN15349?CP 分泌衣殼蛋白的最佳誘導溫度為30℃，與細胞生長溫度接近。對酵母而言，超過30℃的高溫，其自身細胞代謝受到抑制，細胞內醇氧化酶（AOX）活性和細胞能量水平下降，細胞死亡率增加，自身蛋白酶對所表達蛋白的降解性提高。這些都不利于外源蛋白的表達[45?48]。甲醇作為一種雙功能試劑，既是P.pastoris 細胞生長所需的碳源，也是外源蛋白表達的誘導劑。高濃度的甲醇，由于其細胞毒性會抑制細胞的生長，而低濃度的甲醇又會影響蛋白質的分泌表達[46,49]。因此，本研究中的最佳甲醇終濃度為質量分數(shù)0.9%。此濃度可以同時達到細胞生長和外源蛋白分泌的要求。隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物不斷消耗，產(chǎn)物不斷積累，菌體也隨之衰老，細胞分泌蛋白的能力持續(xù)下降。考慮成本和收率后，最佳誘導時間確定為96h。

表1 CCMV蛋白表達條件優(yōu)化L9（33）正交實驗結果

通過正交實驗，研究確定的最佳誘導條件為:誘導溫度30℃、誘導時間96h、每24h 添加甲醇至終濃度（質量分數(shù)）1.0%，此時CCMV CPs的分泌表達量約為(101.4±3.2)mg/L。與文獻報道的一些CCMV CPs表達系統(tǒng)相比（表2），本論文構建的P.pastoris 分泌表達系統(tǒng)簡單、高效，能以較低的成本獲得較高產(chǎn)量（＞100mg/L）和較高純度（＞90%）的活性蛋白，具有較強的優(yōu)勢。

2.3 CCMV CPs體外自組裝和Ru納米顆粒的封裝

將純化后的CCMV CPs 在組裝緩沖液中4℃下透析24h，驗證其體外自組裝VLPs 的能力。如圖7(a)顯示，CCMV CPs 成功組裝成球形病毒樣顆粒，其平均尺寸經(jīng)測量為(27.7±0.6)nm，與天然CCMV VLPs 接近。結果表明，體外組裝的VLPs 是由180個CPs 亞基組成的二十面體結構（三角形剖分數(shù)T=3），證明重組CCMV CPs具有較強的體外自組裝能力。

接著，將CCMV CPs 溶液與制備的檸檬酸穩(wěn)定的Ru 納米顆粒混合，對其進一步進行封裝。圖7(b)可以推斷，Ru 納米顆粒（Ru NPs）被有效地封裝到CCMV VLPs 中，其包封率約為70%，且大部分VLPs 含有數(shù)個Ru NPs。測量結果顯示，Ru@VLPs 的尺寸分布較為寬泛（18～30nm），平均粒徑為(22.8±0.6)nm。由此推測，Ru@VLPs 納米顆粒同時存在T=1、T=2 和T=3 三種組裝結構。具體來說，具有T=1 結構的Ru@VLPs 由60 個CCMV CPs亞基組裝而成，約占總數(shù)的18%（18～22nm）；具 有T=2 結 構 的Ru@VLPs 由120 個CCMV CPs 亞基組裝而成，約占總數(shù)的40%（22～26nm）；而具有T=3 結 構 的Ru@VLPs 約 占 總 數(shù) 的18% （26～30nm）。這種相對較寬的尺寸分布可能由封裝模版顆粒的尺寸不同引起。Ru@VLPs 很可能按照以下方式組裝而成：Ru NPs 與CCMV CPs 溶液混合后，由于離子強度的增加，引起Ru NPs 的部分聚集，形成大小不一的Ru NPs 聚集體。它們作為封裝模板，通過與CCMV CPs之間的靜電引力作用，被快速封裝到VLPs 中。這樣形成了具有不同尺寸的復合納米顆粒。Ru NPs 外層由于有了VLPs 的保護，穩(wěn)定性得到提高。相比之下，未封裝的檸檬酸穩(wěn)定的Ru 納米顆粒（Ru?CA）大多呈聚集狀態(tài)，如圖8所示。制備出的具有核殼結構的復合納米催化劑Ru@VLPs將被用于催化反應進行評價。

表2 CCMV CPs在一些基因工程菌中的表達

圖7 CCMV VLPs和Ru@VLPs TEM圖

2.4 Ru@VLPs催化性能評價

以兩種硝基芳烴化合物，包括4?硝基苯酚（4?NP）以及3?硝基苯磺酸鈉（3?NBS）還原為模型反應，評價復合納米催化劑Ru@VLPs 的催化性能，以Ru?CA作為對照。

2.4.1 4?硝基苯酚（4?NP）還原反應中的催化活性

圖8 Ru?CA的TEM圖及其尺寸分布

首先以4?硝基苯酚（4?NP）還原生成4?氨基苯酚（4?AP）為模型反應，評價Ru@VLPs 的催化活性。4?NP 還原反應的機理研究較為清楚，因此被廣泛用于金屬納米顆粒和復合納米催化劑的催化性能評價[51?53]。4?NP 在320nm 波長處有最大吸收值。加入催化劑開始反應時，4?NP 迅速被還原為中間產(chǎn)物4?羥胺苯酚（4?HP），光譜圖最大吸收波長從320nm 紅移至400nm。Ru@VLP 催化還原4?NP 的全波段掃描實時數(shù)據(jù)如圖9(a)所示。圖中顯示，反應中間物4?HP（400nm）的吸光度逐漸減小，而終產(chǎn)物4?AP（296nm）的吸光度逐漸上升，表明在催化劑Ru@VLPs的作用下，4?NP還原反應持續(xù)進行。

與Ru?CA 相比，Ru@VLPs 具有更高的4?NP催化還原活性。例如：反應14min后，Ru@VLPs上的4?NP轉化率約91%。相比之下，Ru?CA上4?NP轉化率僅為約84%[圖9(b)]。Ru@VLPs 的表觀反應速率常數(shù)（k）經(jīng)進一步計算為0.14min?1[圖9(c)]，約 是Ru?CA 的1.8 倍（0.08min?1）。結 果 表 明，CCMV VLPs 封裝Ru NPs 后，Ru NPs 由于有了蛋白殼的保護而使穩(wěn)定性得到增強。這是引起Ru@VLPs活性提高的一個重要因素。

2.4.2 4?硝基苯酚（4?NP）催化還原反應活化能的估算

Ru@VLPs 和Ru?CA 兩種催化劑在不同溫度下（25～40℃）的催化活性如圖10 所示。很明顯，隨溫度的上升，兩種催化劑上的反應速率均不斷提高。例如，當反應溫度從25℃升高到40℃時，Ru@VLPs 上的k 由0.14min?1提高至0.30min?1[圖10(a)]；Ru?CA 也有相似的趨勢[圖10(b)]。根據(jù)阿倫尼烏斯方程，進一步估算Ru@VLPs 和Ru?CA 上的4?NP 催化還原反應活化能（Ea），如圖10(c)所示。結果顯示，Ru@VLPs 上的反應活化能為32kJ/mol，略低于Ru?CA（39kJ/mol）。Ru@VLPs 上相對較低的活化能可能是由于Ru NPs 與衣殼蛋白內表面相關功能基團（如—NH2）之間的相互作用降低了反應能壘引起的。綜上，與非負載型Ru?CA 相比，Ru@VLPs在4?NP還原反應中催化活性的提高和反應活化能的降低，證明其在催化應用上具有一定的競爭優(yōu)勢。

圖9 4?NP催化還原反應性能

2.4.3 硝基芳烴取代基性質對催化反應的影響

圖10 4?NP催化還原反應活化能的估算

本研究使用4?硝基苯酚（4?NP）和3?硝基苯磺酸鈉（3?NBS）兩種硝基芳烴化合物為底物進行催化還原反應，考察硝基芳烴取代基性質對催化反應的影響。Ru@VLPs 和Ru?CA 兩種催化劑在3?NBS 還原反應中的催化性能如圖11所示。與4?NP還原反應相似，在加入催化劑開始反應時，3?NBS很快被還原至中間產(chǎn)物3?羥胺苯磺酸鈉（3?HBS），最大吸收波長由260nm 紅移至286nm。因此，為簡化計算，3?NBS 的轉化率以中間產(chǎn)物3?HBS濃度的降低為標準。Ru@VLP催化還原4?NBS的全波段掃描實時數(shù)據(jù)如圖11(a)所示。圖中可知，隨反應時間變化，反應中間產(chǎn)物3?HBS（286nm）的吸光度逐漸減小，而終產(chǎn)物3?ABS（238nm）的吸光度逐漸上升，表明在催化劑Ru@VLPs 的作用下，3?NBS還原反應持續(xù)進行。

首先，與Ru?CA 相比，Ru@VLPs 在3?NBS 催化還原中顯示出較高的催化活性，其表觀反應速率常數(shù)（k）經(jīng)計算約0.16min?1[圖11(c)]，為Ru?CA的2.3 倍（0.07min?1）。和4?NP 催化還原相似的結果再次證明Ru@VLPs 在催化應用方面具有一定的優(yōu)勢。

圖11 3?硝基苯磺酸鈉催化加氫反應性能

其次，對比4?NP 和3?NBS 兩組催化還原反應可知，使用未封裝的Ru?CA為催化劑，它在4?NP還原反應上的催化活性較高。例如，反應14min的Ru?CA 的轉化率約84%，而相同條件下的3?NBS轉化率約74%，比Ru?CA 約低10%。然而，以Ru@VLPs 為催化劑時，結果恰好相反。它催化的3?NBS 還原反應具有更高的活性。例如，反應14h的4?NP 轉化率約91%，而相同條件下的3?NBS 轉化率超過95%。4?NP 和3?NBS 兩組催化還原反應的不同結果與硝基芳烴取代基的性質有很大關系。4?NP 取代基為羥基（—OH），它在水溶液中解離程度小，因此分子的電負性相對較低；而3?NBS因磺酸基（—S）的存在而使其在水溶液中呈陰離子狀態(tài)。本文制備的Ru?CA 經(jīng)zeta 電位檢測為?20.2mV，其電負性較強。因此，在Ru?CA催化的3?NBS 還原反應中，Ru?CA 和3?NBS 因靜電斥力作用阻礙了反應的進行，致使催化活性相對4?NP 較低。然而，當Ru?CA 被封裝進VLPs 后，組裝成的納米籠性質與非負載的Ru?CA 產(chǎn)生較大差異。病毒蛋白納米籠內表面富含精氨酸殘基（Arg），因此其內表面呈電正性，可與電負性的Ru?CA 通過靜電引力組裝在一起而保持穩(wěn)定。與此同時，納米籠內部的電正性亦有利于底物3?NBS陰離子通過表面孔道進入腔體內發(fā)生反應，從而引起催化活性的提高。

2.4.4 Ru@VLPs回收再利用

為驗證Ru@VLPs 的再利用性能，催化劑經(jīng)回收后循環(huán)使用4次。結果顯示，催化劑經(jīng)4次循環(huán)使用后，反應10min 的4?NP 轉化率從約82%降至約69%（圖12），催化活性出現(xiàn)了一定程度的下降。這是由于催化劑回收過程較為繁瑣，需要經(jīng)過透析和超濾濃縮等步驟，因此在此過程造成一些Ru@VLPs 納米顆粒的損失，從而導致其活性的下降。結果表明，Ru@VLPs 結構較為穩(wěn)定，具有較好的可回收再利用性。

圖12 Ru@VLPs在4?NP還原反應中的循環(huán)利用

3 結論

成功構建了基于P.pastoris的重組CCMV CPs分泌表達系統(tǒng)，發(fā)酵上清液中的蛋白收率約101mg/L，純度超90%，大大簡化了純化過程。分泌的CCMV CPs具有較強的體外自組裝能力，通過靜電引力作用成功封裝Ru?CA，制備出具有核殼結構的復合納米催化劑Ru@VLPs。與非負載型催化劑Ru?CA相比，它在硝基芳烴還原反應中顯示出較高的催化性能，證明其在催化應用上具有一定的競爭優(yōu)勢。這與CCMV CPs封裝Ru?CA后其分散性和穩(wěn)定性的提高以及Ru 納米顆粒與CCMV CPs 相關功能基團間的協(xié)同作用相關。另外，Ru@VLPs 還具有較好的回收再利用性能。這項研究可為納米材料、仿生催化等新興產(chǎn)業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)病毒樣顆粒提供了一條簡便、綠色的途徑。