微孔聚丙烯膜表面殼聚糖季銨鹽的共價修飾及其抗菌性能

鄭細鳴，范榮玉

（綠色化工技術福建省高等學校重點實驗室，武夷學院生態與資源工程學院，福建武夷山354300）

膜分離技術具有能耗低、分離效率高和易于連續化操作等優勢，已得到廣泛的應用[1]。膜材料是膜分離技術的核心，與無機膜材料相比，高分子膜材料具有耐熱性好、抗化學腐蝕性強、機械性能優異等特點，已成為應用最廣泛的膜材料。但高分子膜材料往往具有很強的疏水性，在服役過程中容易對蛋白質及細菌產生吸附，導致膜的生物污染，極大降低膜的水通量和分離選擇性能，大幅提高膜過程的運行成本[2]。

采用表面涂敷[3?4]、表面接枝[5?8]、界面交聯[9]、共混改性[10?12]、仿生礦化[13?14]等技術對高分子膜表面進行親水化改性，有利于在膜材料表面形成水合層，降低膜對蛋白質及細菌的吸附，延緩膜的生物污染。但親水化改性膜不能殺死在膜表面吸附的少量細菌，這些細菌可以在膜表面生長繁殖，進而形成生物膜。在材料本體或表面涂層中摻入金屬及金屬氧化物納米粒子[15?16]、聚陽離子[17?18]、鹵胺化合物[19?20]等抗菌物質，可賦予膜抑制細菌生長或殺滅細菌的能力，但制得的抗菌材料穩定性差，抗菌劑易流失，抗菌時效較短。通過化學方法將小分子抗菌劑固定于材料表面，可解決材料表面抗菌劑不穩定的問題，但抗菌效果不太理想[21?22]。與小分子抗菌劑相比，高分子抗菌劑（如高分子季銨鹽、季膦鹽等聚陽離子）具有性能穩定、殺菌效果好等優點[23?25]。因此，將高分子抗菌劑共價接枝到膜表面，有望賦予膜優異的抗菌能力。

殼聚糖是甲殼素脫乙酰基后的產物，因具有獨特的生物相容性、生物降解性、無毒性等優點引起人們的重視，在很多領域得到廣泛的應用。殼聚糖分子鏈上的伯氨基在酸性條件下易發生質子化形成聚陽離子，可與細菌細胞中的分子相互作用，抑制營養物質的傳輸，具有抗菌作用[26?29]。但在堿性條件下，殼聚糖分子鏈上的氨基難于質子化形成聚陽離子，不具備抗菌能力。在殼聚糖分子鏈中引入季銨鹽基團，可得到陽離子型殼聚糖季銨鹽，在保持殼聚糖生物可降解和生物親和性的同時，使其具有出色的抗菌活性[30?32]。但殼聚糖季銨鹽水溶性好，作為抗菌劑直接涂覆在材料表面，制得的涂層在潮濕環境或水溶液中穩定性差，極易流失。因此，將殼聚糖季銨鹽應用于材料表面抗菌涂層的構建時，往往需要對其進行交聯改性以提高穩定性[33]。

本研究采用共價修飾技術在高分子膜表面構建穩定的殼聚糖季銨鹽修飾層。以微孔聚丙烯膜為支撐，通過共價接枝改性，將殼聚糖固定于微孔聚丙烯膜表面，再通過殼聚糖分子上胺基與2,3?環氧丙基三甲基氯化銨分子中環氧基團的開環加成反應，成功地在殼聚糖分子鏈中引入季銨鹽基團，從而獲得穩定的殼聚糖季銨鹽修飾層；并探討了修飾膜親水性及其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性及抗菌穩定性。

1 材料和方法

1.1 材料

微孔聚丙烯膜（MPPM），孔徑0.2μm，孔隙率75%，Membrana 公司；丙烯酸（AA），AR，上海凌峰化學試劑有限公司；二苯甲酮（BP），AR，上海雙香助劑廠；1?(3?二甲氨基丙基)?3?乙基碳二酰亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、N?羥基琥珀酰亞胺（NHS），AR，上海共價化學科技有限公司；殼聚糖（CTS），脫乙酰度≥95%，黏度100～200mPa·s，阿拉丁試劑有限公司；熒光素鈉，BR，國藥集團化學試劑有限公司；2,3?環氧丙基三甲基氯化銨（EPTAC），BR，山東東營國豐精細化工廠；胰蛋白胨，BR，國藥集團化學試劑有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，廣東微生物種質資源庫；無水乙醇、丙酮、正庚烷、十二水合磷酸氫二鈉、氫氧化鈉，AR，國藥集團化學試劑有限公司。

AVATAR330 傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），美國Thermo Nicolet 公司；SIRION?100 場發射掃描電子顯微鏡（SEM），荷蘭FEI 公司；PHI?5000C ESCA X 射線光電子能譜儀（XPS），美國Perkin Elmer 公司；UV?2550 型紫外?可見分光光度計，日本島津公司；INTELLIRAY 全功能400W 大面積紫外固化箱，美國Uvitron 公司；JGW?360 型接觸角測定儀，承德市成惠試驗機有限公司。

1.2 MPPM表面殼聚糖季銨鹽的共價接枝

1.2.1 MPPM膜表面CTS的共價接枝

按文獻[34]方法在MPPM 膜表面共價接枝殼聚糖：將MPPM 用25mmol/L 二苯甲酮正庚烷溶液浸泡60min，晾干后用丙酮浸潤4s，迅速用濾紙夾覆并置于培養皿中，注入2.0mL 2.0%～4.0%（體積分數）AA溶液，紫外光照射3min，用去離子水反復清洗，真空干燥至恒重，制得不同接枝量的聚丙烯酸接枝膜（用MPPM?g?PAA表示）；將MPPM?g?PAA浸入5g/L等摩爾的EDC/NHS 檸檬酸緩沖液（pH為5.6）中，25℃下振蕩反應90min，取出并用檸檬酸緩沖液沖洗3次，將膜浸入濃度為5～15mg/L的CTS溶液中，30℃下振蕩反應12h，去離子水反復清洗后真空干燥，制得不同殼聚糖接枝量的膜（用MPPM?g?CTS表示）。MPPM?g?PAA膜表面聚丙烯酸的接枝量GAA(μg/cm2)按式(1)計算，MPPM?g?CTS膜表面殼聚糖的接枝量GCTS(μg/cm2)按式(2)計算。

式中，W0、W1和W2分別為MPPM 膜、MPPM?g?PAA膜和MPPM?g?CTS膜的質量，μg；S為膜的面積，cm2。

1.2.2 膜表面CTS與EPTAC的反應

將不同殼聚糖接枝量的MPPM?g?CTS 膜浸入到10mL 30%的EPTAC 溶液中，60℃下振蕩反應4h。反應后用去離子水洗去膜表面未反應完的EPTAC，真空干燥后得殼聚糖季銨鹽接枝膜（用MPPM?g?QCTS 表示），并用殼聚糖的接枝量來表示不同的MPPM?g?QCTS膜。

1.3 表征方法

修飾過程中，膜表面化學基團的變化采用AVATAR330 傅里葉變換紅外光譜儀分析，膜表面化學成分的變化采用XPS分析，膜表面形態的變化采用掃描電子顯微鏡進行表征，膜表面水接觸角用座滴法測量，膜孔徑和孔隙率采用壓汞儀測量。

1.4 殼聚糖季銨鹽修飾膜的染色法分析

配置一定濃度的熒光素二鈉鹽溶液，將膜在熒光素二鈉鹽溶液中振蕩吸附24h，取出用pH=10的氫氧化鈉清洗，拍照，得到不同膜的熒光素二鈉鹽染色照片。

1.5 膜吸水量的測定

將膜放入去離子水中浸泡6h，取出后用濾紙吸干表面黏附的水，稱重。吸水量Q（mg/cm2）按式(3)計算。

式中，W3和W4分別為樣品膜吸水前和吸水后的質量，mg；S為膜的面積，cm2。

1.6 抗菌性能測試

參考國家標準GB/T 20944《紡織品抗菌性能的評價》方法測試膜的抗菌性能。測試過程：首先將革蘭氏陰性菌大腸桿菌或革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌在無菌營養肉湯中進行恒溫震蕩（37℃、150r/min）活化24h；用無菌營養肉湯和0.03mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）將菌液稀釋至1.0×105CFU/mL；然后取10mL 濃度為1.0×105CFU/mL 菌液和一張膜放入滅過菌的50mL 三角燒瓶中，在37℃和150r/min 條件下恒溫振蕩，每隔一定時間取0.14mL 菌液用0.03mol/L PBS 溶液稀釋到7mL，混勻后移取0.1mL涂布到滅過菌的固體培養基上，37℃倒置培養24h，對表面菌落進行計數。膜的抗菌率A（%）按式(4)進行計算。

式中，C0為抗菌前菌液的濃度，CFU/mL；C1為抗菌后菌液的濃度，CFU/mL。

2 結果與討論

2.1 MPPM膜表面殼聚糖季銨鹽的共價修飾

圖1 MPPM膜表面殼聚糖季銨鹽的共價修飾示意圖

MPPM 膜表面殼聚糖季銨鹽的共價修飾如圖1所示。將MPPM放入到光敏劑二苯甲酮正庚烷溶液中浸泡，使二苯甲酮分子滲入到MPPM中。在紫外光照射下，MPPM分子鏈上的氫被光敏劑二苯甲酮奪取而生成自由基，進而引發AA 在MPPM 上進行接枝聚合反應，制得聚丙烯酸接枝改性的膜（MPPM?g?PAA），從而在膜表面引入大量的羧基；膜表面上的羧基在EDC 和NHS 的作用下，與CTS分子上的氨基反應形成酰胺鍵，使CTS共價接枝到膜的表面，制得殼聚糖接枝改性的膜（MPPM?g?CTS）；再通過膜表面殼聚糖分子上的胺基與EPTAC分子中的環氧基團發生開環加成反應，使膜表面的殼聚糖共價接枝上季銨鹽。

2.2 膜的表征

采用FTIR 對修飾過程中膜表面化學基團的變化進行了分析，結果如圖2 所示。MPPM?g?PAA在1720cm?1處出現了強的C==O 伸縮振動吸收峰；共價接枝CTS 后，1720cm?1處C==O 伸縮振動吸收峰減弱，1560cm?1處增加了歸屬于伯氨基的N—H面內彎曲振動吸收峰，3200～3400cm?1處增加了歸屬于N—H的伸縮振動吸收峰（雙峰），1640cm?1處出現了弱的酰胺C==O 伸縮振動吸收峰；進一步與EPTAC 反應后，1560cm?1處伯氨基的N—H 面內彎曲振動吸收峰消失，同時在1520cm?1處出現了季銨基團甲基中C—H面內彎曲振動峰。

進一步采用XPS分析了修飾過程中膜表面化學成分的變化，結果見圖3。在MPPM 的譜圖中，僅在287eV 處出現C 1s 的發射峰；丙烯酸接枝聚合后，在536eV處增加了歸屬于O 1s的發射峰；共價接枝CTS后，在404eV處新增了歸屬于N 1s的發射峰；進一步與EPTAC反應后，在201eV和272eV處新增了分別對應于Cl 2p 和Cl 2s 的發射峰。以上XPS分析結果進一步證實，在MPPM表面接枝了殼聚糖季銨鹽。

圖2 膜的FTIR譜圖

圖3 膜的XPS 譜

采用帶負電的熒光素二鈉鹽進行染色，可以直觀地判斷季銨化反應是否發生。從圖4可以明顯看到，MPPM 和MPPM?g?PAA 表面均呈現原有的白色，MPPM?g?CTS 表面僅僅帶上非常淺的粉紅色，而MPPM?g?QCTS表面則帶上比較深的橘紅色。這是因為染色過程在中性溶液中進行，MPPM膜表面不帶電荷，MPPM?g?PAA 表面帶有弱的負電荷，它們均難于和帶負電的熒光素二鈉鹽結合而被染色；MPPM?g?CTS上的—NH2在中性溶液中會發生一定程度的質子化而帶上正電荷，可以和帶負電的熒光素二鈉鹽結合而被染色，但用pH=10 的氫氧化鈉溶液清洗后，膜恢復電中性，靜電引力的喪失導致絕大部分已結合的熒光素二鈉鹽重新脫落，因此膜表面僅帶上非常淺的粉紅色；季銨化的MPPM?g?QCTS 表面帶有穩定的、不受pH 影響的正電荷，可以牢固地結合熒光素二鈉鹽，使膜表面呈現橘紅色，且隨著膜表面CTS共價接枝密度的增大，季銨化程度加大，MPPM?g?QCTS表面正電荷密度增大，修飾膜能結合更多的熒光素二鈉鹽使膜顏色變深。

圖4 熒光素二鈉鹽染色膜照片

圖5 膜的SEM圖

采用SEM 考察了修飾過程膜表面形貌變化（圖5）。如圖5 所示，相對于MPPM 膜，共價接枝殼聚糖后膜表面的孔徑變小，但仍存在大量的微孔；進一步與EPTAC 反應后，膜表面形態變化不大，只是孔徑略有變小。從SEM 圖還可看出，膜表面殼聚糖和季銨化殼聚糖的分布均勻，未出現明顯的團聚現象。采用壓汞儀測量了膜的孔徑和孔隙率，發現經過殼聚糖季銨鹽共價修飾后，膜的平均孔徑從MPPM 的0.2μm 降低至0.16μm，孔隙率從75%降低至67%。

2.3 膜的親水性

圖6 顯示了修飾過程膜表面水接觸角的變化。未經修飾的MPPM由于疏水性強，膜表面難于被水潤濕，表面水接觸角高達145°，且基本不隨測試時間的延長而變化。丙烯酸接枝聚合后，膜表面親水性有所增強，水接觸角減小，且水滴會緩慢地在膜表面擴展和滲透。共價接枝殼聚糖和殼聚糖季銨鹽后，膜的表面親水性明顯得到改善，膜表面非常容易被水潤濕，水滴一接觸到膜表面就迅速擴展并滲入膜中，難于準確測出膜的表面水接觸角，說明MPPM?g?CTS和MPPM?g?QCTS具有優異的表面潤濕性能。

圖7為膜的吸水量測試結果。由于MPPM強疏水性，其吸水量非常小，只有0.01mg/cm2；丙烯酸接枝聚合后，由于親水基團—COOH的引入，膜的吸水量有所增加，但也只有0.58mg/cm2；共價接枝殼聚糖后，由于膜的親水性明顯增強，吸水量明顯增大；用EPTAC 季銨化后，膜的親水性進一步增強，吸水量達11.23mg/cm2，為MPPM 的1123 倍，表明MPPM?g?QCTS具有良好的親水性，有利于在水性介質中的應用。

圖6 膜的表面水接觸角

圖7 膜的吸水量

2.4 膜的抗菌性能

圖8顯示了殼聚糖修飾膜和殼聚糖季銨鹽修飾膜對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抗菌性能差異。從圖8可知，未修飾的MPPM膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌沒有抗菌能力，抗菌率為0；共價接枝殼聚糖后，制得的MPPM?g?CTS 膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均顯示出一定的抗菌能力，但抗菌率低于40%；進一步與EPTAC 反應后，制得的MPPM?g?QCTS 則顯示出較強的抗菌能力，且隨著CTS接枝量的增大和抗菌時間的延長，抗菌效果明顯提高。CTS接枝量增大，制得的MPPM?g?QCTS膜表面存在更多能穿透細胞壁的陽離子，抗菌性能增強。當CTS接枝量達684μg/cm2時，制得的MPPM?g?QCTS膜在20min內對大腸桿菌的抗菌率達92%，對金黃色葡萄球菌的抗菌率達96%；延長抗菌時間到80min，MPPM?g?QCTS膜對大腸桿菌的抗菌率提高到98%，對金黃色葡萄球菌的抗菌率則達到100%。將經過抗菌測試的MPPM?g?QCTS 膜用PBS 溶液沖洗3 次后，再次進行80min 的抗菌測試，依此循環進行5次抗菌后，MPPM?g?QCTS膜對金黃色葡萄球菌的抗菌率仍能達95%，對大腸桿菌的抗菌率也能達92%，說明MPPM?g?QCTS膜的抗菌效果穩定。

圖8 不同膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率

圖9 經MPPM?g?QCTS （684μg·cm?2）滅菌80min后菌液細菌的培養照片

3 結論

通過丙烯酸的接枝聚合、殼聚糖的酰胺化反應、2,3?環氧丙基三甲基氯化銨的開環加成三步反應，成功地在MPPM膜表面共價接枝上殼聚糖季銨鹽修飾層。制得的修飾膜具有優異的表面潤濕性和吸水性，吸水量可達11.23mg/cm2，為未修飾MPPM 的1123 倍，有利于在水性介質中的應用。修飾膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均展現出良好的抗菌活性，對大腸桿菌的抗菌率可達98%，對金黃色葡萄球菌的抗菌率可達100%。