蘋果SSR-PCR反應體系的建立與優化

劉 琳，孫曉帥，李 乾，范書臣，時鴻迪，馬 鈞，劉丹丹

（1云南大學農學院，昆明 650091；2西藏大學理學院，拉薩 850000；3云南省農業科學院園藝作物所，昆明 650091）

0 引言

蘋果是薔薇科蘋果亞科蘋果屬(Malus)植物，為多年生落葉喬木，是國內主要的落葉果樹之一，蘋果產業在農業產業結構調整和農民增收中具有重要地位[1]。國內的主產區主要分布在四川、河北、河南、遼寧、山東、山西、陜西、甘肅和新疆等地[2]，不同區域內蘋果的品種和栽培生產方式差異較為明顯，形成了有地域特色的品種優勢，如新疆‘冰糖心富士’、山東‘紅富士’、山西‘秦冠’、河北‘王林’等[3]。中國具有悠久的蘋果栽培歷史，是世界上蘋果種植面積最大、總產量最高的國家[4]，但良種苗木繁育體系不健全是影響蘋果產量的重要原因之一[5]。中國已經成為世界上最大的蘋果生產國和消費國[6]，但自主培育具有地域特色的主栽品種較少，野生和地方特優種質資源的創新與利用日益突出，因此應充分挖掘利用國內資源，擴大優異基因來源，為選育具有自主知識產權的品種提供依據。

國內蘋果種質資源豐富、品種類型多樣，包括大量的野生種、半野生種及栽培品種，在果樹栽培、生產和育種上具有較高的經濟價值[7-9]。目前鑒定植物資源的方法主要有文獻考證、野外考察、標本采集、品種的分類學鑒定以及DNA分子標記等方法[10]。而DNA分子標記是近年來使用最為廣泛的一種遺傳標記形式，也是繼形態學標記、生化標記和細胞標記之后的一種較為理想的標記方法，同時也是一種鑒定種質資源較為有用的技術。它是以蛋白質、核酸分子的突變為基礎，通過檢測生物個體在基因或者基因型上所產生的變異來反映生物個體之間的差異[11]。DNA分子標記包含限制性片段長度多態性技術(RFLP)、序列標簽位點技術(STS)、隨機擴增多態性DNA技術(RAPD)、擴增片段長度多態性技術(AFLP)、簡單序列重復技術(SSR)及單核苷酸多態性技術(SNP)等[12]，其中SSR分子標記應用較為廣泛。SSR分子標記即微衛星DNA，其序列串聯重復，并且主要分布于植物基因組的編碼區和非編碼區中，在分類水平上具有很好的保守性，并且具有突變速率快、多態性高、重復性好、能區分純合子和雜合子等特點，是一種理想的分子標記[13]。蘋果SSR標記主要基于二核苷酸重復序列進行開發[14]，SSR標記通過基因組掃描技術(GSA)及譜系基因分型技術可以很好地覆蓋蘋果基因組[15]，前者主要用于繪制基因的抗性基因[16]，后者主要用于等位基因的挖掘以及對性狀關聯的評估[17]。由于不同物種的最佳SSR-PCR反應體系不同，有必要對蘋果屬植物的SSR-PCR反應體系進行優化確定。

筆者以21種蘋果屬植物作為實驗材料，采用L16正交實驗對模板濃度、引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度以及Top Taq酶濃度等5個因素進行優化，并通過退火溫度梯度實驗對SSR-PCR擴增體系進行優化改良，旨在為利用SSR分子標記鑒定薔薇科蘋果屬植物種質資源提供實驗技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗于2018—2019年在云南省云南大學農學院進行，所有實驗均重復3次。實驗所采用的21種蘋果屬材料均采自云南省昭通市水果推廣站實驗基地，詳見表1。利用隨機抽取的‘粉紅女士’品種的DNA作為SSR-PCR反應優化體系模板。引物設計參照Liebhard等[18]的研究，由擎科生物工程股份有限公司合成，詳見表2。PCR反應所用的dNTPs、Top Taq酶、DNAmarker，10×Top Taq buffer(Mg2+)以及6× DNA上樣緩沖液購自云南金邦（普麥）生物科技有限公司(AP151-11)。

表1 21種蘋果屬植物

1.2 儀器設備

高速離心機(HC-2518)，供試PCR儀(Eppendorf AG 22331)，瓊脂糖凝膠電泳儀(DYCP-31DN)，聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(MGV-202-33)，切膠儀（天根生物科技有限公司），超微量分光光度計(tGem Spectrophotometer Plus)。

表2 引物序列

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取及質量檢測

（1）DNA提取。方法參照Easy plant Genomic DNA kit（云科生物技術有限公司，code#E11101）。21種蘋果屬材料分別取0.1 g的嫩葉組織，液氮研磨后，參照DNA提取試劑盒說明書提取，提取的DNA用65℃預熱的100 μL ddH2O溶解，-20℃保存。

（2）濃度檢測。通過超微量分光光度計檢測DNA濃度。1 μL ddH2O進行調零，檢測1 μL DNA待測液的濃度及OD260/OD280值，取OD值于1.8～2.0范圍內的DNA用于后續實驗。

1.3.2 SSR-PCR反應體系正交設計實驗 隨機挑選‘粉紅女士’作為優化體系的DNA模板，CH01h021作為引物，對表3中的引物濃度、Top Taq buffer(Mg2+)、dNTPs、Top Taq酶以及引物濃度等5個因素的4個水平進行正交實驗，L16(45)16個組合體系正交表結果如表4。反應體系總體積為25μL，實驗3次重復。

1.3.3 PCR擴增與檢測

（1）PCR擴增程序。94℃預變性5 min，94℃變性30 s，49～58℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 35個循環，72℃后延伸10 min，PCR產物4℃保存。取1μLPCR擴增產物加入0.2μL DNA上樣緩沖液，分別用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳及8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。

（2）產物檢測。根據瓊脂糖凝膠電泳的條帶清晰度以及條帶的數量判斷模板濃度、引物、Mg2+、dNTPs以及Top Taq酶濃度是否適合反應體系；根據聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶的清晰度來篩選引物。

1.3.4 最適SSR-PCR反應溫度的篩選 參照何正文等[19]的實驗方法，對聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)條帶進行判斷和篩選，其中特異性強、彌散度弱、條帶清晰的條帶視為正確擴增條帶。根據擴增正確條帶數判斷SSR-PCR反應最適組合。

表3 SSR-PCR反應體系因素及水平

表4 蘋果屬植物SSR-PCR反應的正交實驗設計[L16(45)]

運用最佳的SSR-PCR反應體系進行PCR實驗，設置PCR反應程序不變，將退火溫度設置49、52、55、58℃4個溫度梯度進行實驗（根據引物的退火溫度設定），尋找最適退火溫度。

2 結果與分析

2.1 薔薇科蘋果屬品種DNA提取及濃度測定

對21個品種的DNA進行提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，所有樣品的譜帶清晰明亮，無明顯雜質，DNA完整性較好（圖1）。隨后通過DNA濃度和純度的測定，篩選出OD260/OD280值在1.8～2.0之間DNA樣品（表5）。

2.2 蘋果屬植物SSR-PCR反應體系的優化

隨機選取CH01h021作為引物（表2），根據表3中16個不同濃度梯度水平的組合進行PCR擴增，將反應產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗(PAGE)。由SSR-PCR正交實驗結果可以看出，不同組合的擴增結果差異明顯，組合6、11、14下擴增出的條帶數量多且條帶清晰明亮。經過多次重復實驗發現組合11、14所擴增出的條帶清晰度較高，實驗結果較為穩定（圖2）。經過多次實驗證明，組合14可作為最優體系，即30～60 ng DNA模板、1.2μL正反向引物(5μmol/L)、0.5μL dNTPs(2.5 mmol/L)、0.5 μL Top Taq酶(2.5 U/μL)以及2.5 μL 10×Top Taq buffer（含Mg2+），用ddH2O補至25μL。

為進一步證明初步結論的準確性，對正交實驗的各因素及水平進行分析（表6），其中K值代表在同一水平下所產生的擴增條帶的平均值，R值能夠反映某因素的極差，R值越大影響越顯著。通過對模板DNA濃度、引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度、Top Taq酶濃度5個因素在4個水平內的綜合分析發現，對結果影響從大到小依次為引物濃度、Top Taq buffer(Mg2+)、模板DNA濃度、Top Taq酶及dNTPs。經驗證，上述實驗中所獲得的SSR-PCR反應體系為適合本實驗的最適體系。

表5 21種蘋果屬植物品種的DNA濃度及OD值測定結果

圖1 薔薇科蘋果屬DNA質量檢測電泳結果

圖2 正交設計SSR-PCR反應體系擴增（聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測）結果

2.3 最適退火溫度的篩選

引物的退火溫度對PCR結果的影響較大，為減少誤差，在以上反應體系的基礎上對引物的退火溫度進行了篩選。結果發現，當退火溫度為52℃時，PCR擴增出的條帶數目清晰（圖3）。

2.4 最佳反應體系的穩定性檢驗

為了檢測SSR-PCR反應的穩定性，隨機選用另外一對引物CH03d11進行驗證。以21種薔薇科蘋果屬品種DNA為模板，利用優化后的SSR-PCR反應體系進行擴增，結果發現，21個品種的擴增結果條帶清晰，無拖帶并且大部分都具有2個或者3個等位基因，大小在100～200 bp左右（圖4），說明該擴增體系比較穩定，可應用于薔薇科蘋果屬植物SSR擴增反應。

3 結論與討論

SSR是基于特異性引物進行PCR的分子標記技術[20]，凡是影響PCR擴增效果的因素，如Mg2+、DNA聚合酶、引物、模板DNA、dNTPs等，均會影響到SSR-PCR的結果。不同物種的SSR-PCR分析報道雖多，但大多是采取單因素梯度實驗，過程復雜且不能兼顧各因素之間的相互影響[21-22]。本試驗采用正交設計實驗能夠分析不同因素之間的交互作用[23]，同時也克服了單因素實驗規模巨大、顧此失彼的問題[24]，此種方法效率更高、穩定性更好，能夠較為全面地找出各因素之間的規律[25]。因而本試驗以此來獲得最優反應體系，減少SSR技術的誤差。

表6 SSR-PCR反應體系的正交實驗直觀分析

圖3 SSR-PCR反應體系最佳退火溫度

圖4 SSR-PCR最佳反應體系檢驗結果

本試驗研究前期參考Liebhard等[18]的研究，共選取了108對引物，通過瓊脂糖凝膠電泳試驗篩選出32對引物，本試驗隨機挑選了其中的2對引物進行后續的體系優化。研究發現，瓊脂糖凝膠電泳的條帶極易發生彌散拖尾現象，當模板濃度過低時產物容易彌散；模板濃度過高時引物與dNTPs過早耗盡，結果不穩定；引物濃度過高時會產生非特異性產物，極易形成引物二聚體[26-27]。PCR產物拖尾主要是由于退火溫度過低，當退火溫度較低時容易出現條帶拖尾。通過正交設計實驗發現，在SSR-PCR反應過程中，引物濃度的影響最為明顯，但模板濃度、dNTPs、Mg2+以及退火溫度也起到了較為關鍵的作用，需根據實驗的具體要求靈活安排以提高結果的準確性，將人為因素降低到最小。在整個實驗過程中，確定每個引物的最適退火溫度實驗過程比較繁瑣，本研究只列舉了引物CH03d11的退火溫度。當采用多個引物同時擴增時，反應程序可采用降落PCR方法[28]，降落PCR能夠有效降低各組分濃度及退火溫度引起的非特異性產物產生，大大縮短實驗時間。通過本實驗，最終確定適用于薔薇科蘋果屬植物SSR-PCR的最適反應體系為：30～60 ng DNA模板，1.2μL正反向引物(5μmol/L)，0.5μL dNTPs(2.5 mmol/L)，0.5 μL Top Taq酶(2.5 U/μL)以及2.5μL10×TopTaqbuffer（含Mg2+），用ddH2O補至25μL。該體系經過驗證可用于后續薔薇科蘋果屬植物變異遺傳穩定及分子身份證的構建研究。