葫蘆素B 通過調控HERG1 對膀胱癌細胞增殖、遷移侵襲和放射敏感性的影響

董建設 李 豪 趙俊峰 陳瑞廷 張林超 賈占奎

（1.河南省中醫院 泌尿外科， 河南 鄭州450000； 2.鄭州大學第一附屬醫院 泌尿外科， 河南 鄭州450000）

膀胱癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一，其治療策略包括手術、放療、化療等，但因其浸潤性難根除、放化療不敏感而導致療效差、易復發［1］。增強膀胱癌細胞的放化療敏感性是提高治療效果的重要途徑之一，研究［2］發現放療配合中醫藥可以提高腫瘤患者生存質量和機體免疫功能、提高對放療的敏感性及預防腫瘤轉移與復發。葫蘆素屬于葫蘆烷型四環三萜類化合物，分離自葫蘆科植物，對多種腫瘤具有抑制作用，此類藥物還能提高放療的敏感性，而葫蘆素B 是葫蘆素類化合物的一種［3］。研究發現葫蘆素B 可抑制卵巢癌［4］、胃癌［5］、肺癌［6］、前列腺癌［7］、結腸癌［8］等腫瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡。葫蘆素B 能夠逆轉人乳腺癌細胞MCF-7／Dox 細胞耐藥性［9］；且能逆轉順鉑對胃癌細胞耐藥作用［10］；而葫蘆素B 對膀胱癌增殖、遷移侵襲和放射敏感性的影響還未見報道。人類eag相關基因（human ether-a-go-go-related gene，HERG1） 是鉀離子通道家族成員之一，過表達HERG1 可以增強胰腺癌細胞的放射敏感性［11］。HERG1 對膀胱癌的放射敏感性的作用尚未清楚?；谝陨涎芯?，本實驗旨在研究葫蘆素B 和HERG1 對膀胱癌細胞增殖、遷移侵襲和放射敏感性的影響及它們之間的關系。

1 材料

1.1 細胞 膀胱癌細胞T24 購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物與試劑 葫蘆素B（批號A0649，四川成都曼斯特生物有限公司）；胎牛血清（批號871301）、DMEM 培養（批號8112066） 均購自美國 Gibco 公 司；RNA 提取試劑盒（批號15596026，美國Invitrogen 公司）；反轉錄試劑盒（批號RR037 A，日本Takara 公司）；AceQ qPCR SYBR? Green Mix（貨號Q121-02，南京諾唯贊生物科技有限公）；LipofectamineTM2000 轉染試劑盒（批號11668-019，美 國Invitrogen 公 司）；MTT（批號9710，美國Sigma 公司）；蛋白提取試劑盒（批號BC3640，北京索萊寶科技有限公司）；BCA 試劑盒（批號0226160511，上海碧云天生物技術有限公司）；Transwell 小室、Matrigel 膠（批號353096，美國BD 公司）；兔抗人Cyclin D1抗體（貨號santa sc-753，廣州沛瑜生物制品有限公 司）；兔抗人 MMP-2抗體（貨號 santa sc-10736，廣州沛瑜生物制品有限公司）；兔抗人p21 抗體（貨號22780002，上海煊翎生物科技有限公司）；兔抗人MMP-9 抗體（貨號PAB0982，上海煊翎生物科技有限公司）；兔抗人HERG1 抗體（貨號sc-1596，美國Santa Cruz 公司）；兔抗人GAPDH 抗體（貨號XFC1665，上海信帆生物科技有限公司）；山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶（HRP，貨 號GB23303，塞維爾生物技術有限公司）。

1.3 儀器PCR擴增儀（型號5331，德國Eppendorf公司）；酶標儀（型號MODEL680，美國Bio-Rad公司）；倒置顯微鏡（型號 CKX31-A11PHP，日本Olympus 公司）；Co60 醫療照射裝置（型號FC-50，中國核動力研究院）。

2 方法

2.1 細胞培養 T24 細胞培養于DMEM 培養基，其中包含10% FBS，在37℃，5% CO2恒溫箱常規培養。每2～3 天傳代1 次。

2.2 葫蘆素B 儲存液制備 稱取20 mg 葫蘆素B，加入DMSO 溶液4 mL，配成質量濃度為5 mg／mL，攪拌均勻后，抽濾無菌培養，-20℃避光保存，使用時按所需濃度按比例稀釋。

2.3 細胞轉染 取常規培養的T24 細胞于6 孔板中，細胞融合至80% 的生長狀態時，用無血清培養基培養12 h，以同步化細胞。將si-NC、si-HERG1、pcDNA 和pcDNA-HERG1 質粒分別轉染至T24 細胞中，分 為si-NC組、si-HERG1組、pcDNA組、pcDNA-HERG1組，轉染通過LipofectamineTM2000 試劑盒，依照說明書的步驟進行操作。經pcDNA、pcDNA-HERG1 轉染后，分別加入10 μmol／mL 葫蘆素B 培養48 h，即葫蘆素B＋pcDNA組、葫蘆素B＋pcDNA-HERG1組。

2.4 MTT 法測定細胞增殖 參考譚立君［4］實驗研究方法，取對數生長期T24 細胞接種于96 孔板（1×104／孔） 培養，DMEM 培養液培養24 h，加入葫蘆素B（0.1、1、10 μmol／L） 培養48 h；陽性對照藥組加入100 nmol／L 紫杉醇處理T24 細胞48 h。每孔加入20 μL MTT（5 g／L） 試劑，孵育4 h，加入150 μL DMSO，震蕩混勻，在酶標儀測定各孔450 nm 波長處OD。每組設3個復孔取均值，將對照組細胞抑制率設定為0。其余各組細胞抑制率＝［1-（OD實驗組／OD對照組）］×100%。

2.5 RT-PCR 檢測HERG1 mRNA 表達 按照Trizol說明書提取T24 細胞總RNA，反轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，AceQ qPCR SYBR? Green Mix 試劑盒用于RT-PCR 擴增。反應程序為95℃、30 s，60℃、30 s；72℃、30 s，共40個循環；60℃延長5 min。采用2-△△ct法計算HERG1 mRNA 相對表達量。HERG1 正向5′-GTCGACGGACTCGCTTTCTCAGGT-3′，反 向 5′-GCGGCCGCACTGCCCGGGT-3′；β-actin正向5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，反向5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。

2.6 Western blot 檢測增殖、遷移侵襲相關蛋白表達 提取各組T24 細胞蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒定量測定。蛋白上樣量為60 μg，SDS-PAGE 分離，采用電轉將其轉到PVDF 膜。在5%脫脂牛奶封閉液中封閉1.5 h，加 入一抗（Cyclin D1、MMP-2、p21、MMP-9、HERG1、GAPDH ），于4℃條件下孵育過夜；再加入山羊抗兔IgG-HRP二抗，在室溫條件下孵育2 h，暗室中顯影，定影。采用Quantity One 軟件分析處理蛋白條帶的吸光度，將蛋白表達水平表示為目的條帶與GAPDH 條帶的比值。

2.7 Transwell 檢測細胞遷移、侵襲 用無血清培養基重懸各組T24 細胞，制成2×104／mL 細胞懸液。遷移測定實驗，Transwell 小室上室接種細胞懸液200 μL，下室接種含血清培養基600 μL，37℃孵育24 h。之后用無菌棉簽去除上層T24 細胞，PBS 充分清洗，依次在4% 多聚甲醛與0.1%結晶紫中固定30 min、染色10 min，顯微鏡隨機捕獲5個視野進行拍照，計算結晶紫其中染色的細胞數目即為遷移細胞數。侵襲測定實驗以1∶5 比例加入RPMI 1640 培養液稀釋Matrigel 后，涂覆Transwell上室，干燥后根據上述細胞遷移實驗的步驟進行后續操作，統計侵襲細胞數。

2.8 細胞克隆形成實驗測定細胞放射敏感性 取各組細胞分別給予0、2、4、6、8 Gy Co60 醫療裝置照射。按照射劑量大小分別以0.3×103、1×103、1×103、3×103、3×103個細胞接種于60 mm 培養皿中，孵育10～14 d。依次使用甲醇和吉姆薩進行固定15 min，染色30 min，通過低倍光學顯微鏡記錄多于50個細胞的集落。克隆形成率（planting efficiency，PE） ＝（克隆數／接種細胞數） ×100%，存活分數（survial fraction，SF） ＝照射劑量組的集落數／（該組細胞接種數×未照射組PE）。采用單擊多靶模型 擬合細胞存活曲線，SF＝1-（1-e-D／D0） N，Dq＝D0×lnN。其中D 為照射劑量（Gy），D0為平均致死劑量，Dq為準閾劑量（代表存活的寬肩度），N 為外推值。放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER） ＝單純照射組D0／加藥聯合照射組D0。

2.9 統計學分析 采用GraghPad Prism5 擬合細胞存活曲線。采用SPSS 20.00 軟件進行分析。計量資料以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 葫蘆素B 對T24 細胞增殖、遷移、侵襲的影響 葫蘆素B（0.1、1、10 μmol／L） 及紫杉醇抑制T24 細胞增殖、遷移、侵襲，呈濃度依賴型（P＜0.05），見圖1、表1。Western blot 結果顯示（圖2、表2），與對照組比較，葫蘆素B（0.1、1、10 μmol／L） 及紫杉醇抑制T24 細胞Cyclin D1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達，促進p21 蛋白表達（P＜0.05）。

圖1 葫蘆素B 對T24 細胞遷移侵襲的影響Fig.1 Effects of Cu B on T24 cells migration and invasion

表1 葫蘆素B 對T24 細胞增殖和遷移侵襲的影響（， n＝12）Tab.1 Effects of Cu B on T24 cells proliferation，migration and invasion（， n＝12）

表1 葫蘆素B 對T24 細胞增殖和遷移侵襲的影響（， n＝12）Tab.1 Effects of Cu B on T24 cells proliferation，migration and invasion（， n＝12）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與葫蘆素B 0.1 μmol／L組比較，＃P＜0.05；與葫蘆素B 1 μmol／L組比較，▲P＜0.05。

圖2 Western blot 檢測增殖、遷移侵襲相關蛋白表達Fig.2 Expression of proliferation，migration and invasionassociated proteins determined by Western blot

3.2 葫蘆素B 對T24 細胞放射敏感性的影響 細胞克隆形成實驗后，通過單擊多靶模型擬合計算得出（表3），在膀胱癌細胞中對照組、葫蘆素B（0.1、1、10 μmol／L）組 D0值分別是2.855、1.939、1.619、1.288，0.1、1、10 μmol／L 葫蘆素B 放射增敏比（SER） 分別是1.472、1.764、2.216。細胞存活擬合曲線（圖3） 顯示，在同一劑量照射下，葫蘆素B 聯合照射組存活率明顯小于單純照射對照組，細胞的存活曲線明顯下移；且隨著照射劑量和葫蘆素B 濃度的增加，曲線下移的趨勢呈現直線型?？梢?，葫蘆素B 對T24 細胞具有輻射增敏作用。

3.3 葫蘆素B 對膀胱癌細胞中HERG1 表達影響 如圖4、表4 所示，與對照組比較，葫蘆素B組HERG1 mRNA 及蛋白表達降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。葫蘆素B 抑制膀胱癌細胞中HERG1 表達。

表2 葫蘆素B 對T24 細胞增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的影響（， n＝12）Tab.2 Effects of Cu B on the expression of T24 cells proliferation，migration and invasion-associated proteins（，n＝12）

表2 葫蘆素B 對T24 細胞增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的影響（， n＝12）Tab.2 Effects of Cu B on the expression of T24 cells proliferation，migration and invasion-associated proteins（，n＝12）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與葫蘆素B 0.1 μmol／L組比較，＃P＜0.05；與葫蘆素B 1 μmol／L組比較，▲P＜0.05。

表3 單擊多靶模型參數Tab.3 Click on multi-target model parameters

圖3 不同劑量照射后T24 細胞的存活曲線Fig.3 Survival curve for T24 cells exposed to different doses of irradiation

圖4 Western blot 檢測HERG1 蛋白表達Fig.4 Determination of HERG1 protein expression by Western blot

表4 葫蘆素B 對T24 細胞中HERG1 表達的影響（，n＝12）Tab.4 Effects of Cu B on T24 cells HERG1 expression（， n＝12）

表4 葫蘆素B 對T24 細胞中HERG1 表達的影響（，n＝12）Tab.4 Effects of Cu B on T24 cells HERG1 expression（， n＝12）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與葫蘆素B 0.1 μmol／L組比較，＃P＜0.05；與葫蘆素B 1 μmol／L組比較，▲P＜0.05。

3.4 抑制HERG1 表達對T24 細胞增殖和遷移侵襲的影響 與si-NC組比較，si-HERG1組T24 細胞抑制率增加，遷移、侵襲細胞數減少，HERG1、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達降低，p21 蛋白表達升 高（P＜0.05），見 圖5～6、表5～6。

圖5 抑制HERG1 表達對T24 細胞遷移侵襲的影響Fig.5 Effects of inhibited HERG1 expression on T24 cells migration and invasion

表5 抑制HERG1 表達對T24 細胞增殖和遷移侵襲的影響（， n＝6）Tab.5 Effects of inhibited HERG1 expression on T24 cells proliferation and migration（， n＝6）

表5 抑制HERG1 表達對T24 細胞增殖和遷移侵襲的影響（， n＝6）Tab.5 Effects of inhibited HERG1 expression on T24 cells proliferation and migration（， n＝6）

注：與si-NC組比較，*P＜0.05。

圖6 Western blot 檢測HERG1 和增殖、遷移侵襲相關蛋白表達Fig.6 Expression of HERG1 and proliferation，migration and invasion-associated proteins determined by Western blot

表6 抑制HERG1 表達對T24 細胞增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的影響（， n＝6）Tab.6 Effects of inhibited HERG1 expression on expression of T24 cells proliferation，migration and invasion-related proteins（， n＝6）

表6 抑制HERG1 表達對T24 細胞增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的影響（， n＝6）Tab.6 Effects of inhibited HERG1 expression on expression of T24 cells proliferation，migration and invasion-related proteins（， n＝6）

注：與si-NC組比較，*P＜0.05。

3.5 抑制HERG1 表達對T24 細胞放射敏感性的影響 細胞克隆形成實驗后，通過單擊多靶模型擬合計算得出（表7），在T24 細胞中si-NC組和si-HERG1組 的 D0值分別是 2.669、1.456，si-HERG1組的放射增敏比（SER） 是1.833。細胞的存活擬合曲線（圖7） 顯示，在同一劑量照射下，si-HERG1 聯合照射組的存活率明顯小于單純照射si-NC組，細胞的存活曲線明顯下移；且隨著照射劑量的增加，曲線下移的趨勢呈現直線型。抑制HERG1 表達對膀胱癌細胞具有輻射增敏作用。

圖7 不同劑量照射后T24 細胞的存活曲線Fig.7 Survival curve for T24 cells exposed to different doses of irradiation

3.6 HERG1 過表達逆轉了葫蘆素B 對T24 細胞增殖、遷移侵襲和放射敏感性的作用 與葫蘆素B＋pcDNA組，葫蘆素B＋pcDNA-HERG1組膀胱癌細胞抑制率降低，遷移、侵襲數量升高，HERG1、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達升高，p21 蛋白表達降低（P＜0.05），見圖8～9、表8～9。

表7 單擊多靶模型參數Tab.7 Click on multi-target model parameters

圖8 HERG1 過表達逆轉了葫蘆素B 對T24 細胞遷移侵襲和放射敏感性的作用Fig.8 HERG1 overexpression reverses the effect of Cu B on T24 cells migration，invasion and radiosensitivity

細胞克隆形成實驗后，通過單擊多靶模型擬合計算得出（表10），在膀胱癌細胞中對照組、葫蘆素B組、葫蘆素B＋pcDNA組和葫蘆素B＋pcDNAHERG1組的D0值分別是2.690、1.409、1.260、2.072，葫蘆素B組、葫蘆素B＋pcDNA-HERG1組的放射增敏比（SER） 分別是1.909、0.608。細胞的存活擬合曲線（圖8B） 顯示，在同一劑量照射下，葫蘆素B 聯合照射組的存活率明顯小于單純照射對照組，細胞的存活曲線明顯下移；而葫蘆素B＋pcDNA-HERG1 照射組的存活率大于葫蘆素B＋pcDNA 照射組。HERG1 過表達逆轉了葫蘆素B對膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲的抑制及放射增敏的作用。

表8 HERG1 過表達逆轉了葫蘆素B 對T24 細胞增殖、遷移侵襲的作用（， n＝12）Tab.8 HERG1 overexpression reverses the effect of Cu B on T24 cells proliferation，migration and invasion（，n＝12）

表8 HERG1 過表達逆轉了葫蘆素B 對T24 細胞增殖、遷移侵襲的作用（， n＝12）Tab.8 HERG1 overexpression reverses the effect of Cu B on T24 cells proliferation，migration and invasion（，n＝12）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與葫蘆素B＋pcDNA組比較，＃P＜0.05。

圖9 Western blot 檢測HERG1 和增殖、遷移侵襲相關蛋白的表達Fig.9 Expression of HERG1 and proliferation，migration and invasion-associated proteins determined by Western blot

4 討論

膀胱癌是威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其術后復發率和病死率高，嚴重影響患者的生活質量［12］。葫蘆素B 是從中草藥中提取的一種化合物，具有抗腫瘤活性作用［13］。葫蘆素B 通過調節sestrin-3 可抑制肺癌細胞增殖，誘導細胞凋亡［14］。葫蘆素B 能明顯抑制食管鱗癌EC109 細胞的增殖和遷移，與射線聯合使用時能誘導細胞凋亡，引起G2／M 期細胞阻滯，且隨藥物濃度增加放射敏感性增強，具有放射增敏效應［15］。葫蘆素B 還可誘導人卵巢癌紫杉醇耐藥細胞A2780／Taxol 的凋亡［16］。本實驗通過用不同濃度葫蘆素B 處理膀胱癌細胞，檢測葫蘆素B 對膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響，結果顯示，紫杉醇和不同濃度葫蘆素B 處理的膀胱癌細胞，細胞增殖抑制率顯著升高，細胞遷移和侵襲數量顯著降低，且Cyclin D1、MMP-2和MMP-9 表達顯著降低，p21 表達顯著升高。說明紫杉醇和葫蘆素B 均能抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲，且葫蘆素B 對膀胱癌的抑制作用呈濃度依賴性。而且本研究結果還發現，隨著照射劑量和葫蘆素B 濃度的增加，細胞存活曲線下移，放射增敏比升高。說明葫蘆素B 對膀胱癌細胞具有輻射增敏作用，增強了膀胱癌T24 細胞的放射敏感性。

表9 HERG1 過表達逆轉了葫蘆素B 對T24 細胞增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的作用（， n＝12）Tab.9 HERG1 overexpression reverses the effect of Cu B on expression of T24 cells proliferation，migration and invasionrelated proteins（， n＝12）

表9 HERG1 過表達逆轉了葫蘆素B 對T24 細胞增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的作用（， n＝12）Tab.9 HERG1 overexpression reverses the effect of Cu B on expression of T24 cells proliferation，migration and invasionrelated proteins（， n＝12）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與葫蘆素B＋pcDNA組比較，＃P＜0.05。

表10 單擊多靶模型參數Tab.10 Click multi-target model parameters

有研究發現HERG1 在大腸癌中高表達，可作為其診斷和治療的生物學標志物和治療靶點［17］。HERG1 在口腔鱗狀細胞癌和乳腺癌的上調表達，與其預后相關［18-19］。HERG1 在結腸癌中高表達，敲低可以抑制細胞增殖，與利魯唑可降低結直腸癌細胞順鉑耐藥的能力［20］。本研究發現，抑制HERG1 表達，細胞增殖抑制率顯著升高，細胞遷移和侵襲數量顯著降低，且Cyclin D1、MMP-2、MMP-9 表達顯著降低，p21 表達顯著升高。說明抑制HERG1 表達可抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本實驗還發現抑制HERG1 表達可增強膀胱癌細胞的放射敏感性。HERG 與葫蘆素B 的相互影響還未見相關報道，本實驗結果顯示在葫蘆素B處理的膀胱癌細胞中HERG1 低表達；過表達HERG1 逆轉了葫蘆素B 對膀胱癌T24 細胞增殖、遷移和侵襲抑制和放療增敏的作用。提示葫蘆素B可能通過調控HERG1 的表達影響膀胱癌細胞的增殖、遷移、侵襲和放射敏感性。

綜上所述，葫蘆素B 具有抑制膀胱癌T24 細胞增殖、遷移和侵襲的作用，還可提高細胞的放射敏感性，并且其作用機制可能與調控HERG1 的表達有關，將可為膀胱癌的預防和治療提供新思路。