LuxS基因對變異鏈球菌耐酸性的影響研究

西安醫學院口腔醫學院 陜西 西安 710021

變異鏈球菌(Streptococcus mutans,S．mutans,以下簡稱為變鏈菌)一直被認為是最重要的致齲菌[1],在人們的口腔微環境中占有很關鍵的生態地位。在其諸多致齲的特性中,耐酸性是一個非常關鍵的因素。耐酸性主要是指細菌能在酸性環境中生長,并在這種環境下代謝碳水化合物產酸的水平。耐酸性包括了2個層面的概念[2－3],分別被稱為基本耐酸(Constitutive acidtolerance)以及耐酸反應(Acid tolerance response,ATR)。此次實驗中介紹了變鏈菌標準株和LuxS缺陷株分別在不同p H值酸性環境下的生長狀況,為下一步的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 實驗菌株和培養基 變鏈菌Ingbritt C國際標準株及本實驗室成功構建并保存的LuxS基因缺陷株[3];TSA固體培養基及牛心腦浸液培養基(BHI)。

1．2 儀器設備和試劑 紫外分光光度計,美國BECKMAN公司;TGL－16C高速冷凍離心機,上海飛鴿;電熱恒溫水浴箱,杭州藍天化檢儀器廠;隔水式恒溫培養箱,上海安亭科學儀器廠;R200電子天平,德國;進口96孔微量板。

1．3 實驗方法 將變鏈菌Ingbritt C標準株和LuxS缺陷株常規復蘇,提純鑒定為純菌后,分別于4℃、3 000 r/min離心l5min并棄去上清液,將收集的細菌沉淀物用無菌生理鹽水稀釋,振蕩器振蕩混勻1 min后,用紫外分光光度計于600 nm處調整制備為吸光度(A)約為0．7的菌懸液備用。

配制p H值3．5～7．0、間隔0．5的一系列BHI液體培養基,按照l∶10(V/V)的比例將兩種菌液接種于BHI液體培養基,兩種菌株均培養48 h,并設置為3份樣品。離心棄清后逐一測定吸光度值,以無菌生理鹽水為陰性對照。將兩菌液接種于配制好的p H值3．0的BHI液體培養基,在酸化培養前后分別取樣稀釋,菌液濃度在菌落計數器上計數并推算出來,算出的比值即酸化前后菌液濃度之比,又稱之為生存率。

1．3．3 統計學分析 應用SPSS 13．0軟件包進行數據分析,實驗數據以均值±標準差(±s)表示,通過雙因素方差分析來比較不同p H組和菌種間的差異,檢驗水準α＝0．05。

2 結果與分析

如表1所示,p H值為6．0～7．0時,標準株和LuxS缺陷株均生長良好,同一p H值時和3組不同p H值下,兩菌株細菌的生長差異均無統計學意義;p H值5．5時,兩菌株生長均受到影響,其吸光度都顯著下降;p H值5．0時,缺陷株生長受到明顯抑制,而標準株仍保持一定的生長態勢;p H值4．5時,缺陷株與標準株相比幾乎沒有表現出生長態勢,而標準株生長也受到了明顯影響;p H值4．0、3．5時,兩種菌株的生長態勢都不明顯;將兩菌株在p H值3．0下培養30 min,缺陷株生存率(0．0064%)與標準株生存率(0．0790%)相比明顯降低。

表1 變鏈菌標準株和LuxS缺陷株在不同p H下吸光度(A)值的比較

當變鏈菌長期生長在相對低的p H值環境時,可能發生耐酸反應,隨之其會具備一定的適應性耐酸能力。從表中實驗結果可知,LuxS基因缺陷株一定程度下能適應相對微弱的酸性環境,其生長可以不受很大影響,仍能正常進行。由于變鏈菌攝取食物中的糖類后,進行無氧酵解并馬上產生大量的酸,酸積聚促進了對牙菌斑的酸沖擊,最終會導致牙釉質脫礦,從而促進齲齒形成。體內p H遙感監測證明,在3 min內,受到年齡階段、牙菌斑的成分和食物中碳水化合物濃度的影響,牙菌斑p H值會隨著糖類的攝入逐漸從7．0降低到4．0[4]。對變鏈菌指數期浮游細胞的研究顯示,p H值從7．5變為5．5超過2 h就會誘導酸耐受反應,其在p H 3．0下的生存率就會得以提高。因此此次研究將p H值5．5選作預酸化的p H值。p H值5．5時,兩種菌株的吸光度都明顯降低,其生長能力顯著變弱?？赡苁且驗榫鷥榷喾N酶和細菌細胞壁在外周酸性p H值的影響下受到了損傷,其完整性及通透性產生了變化,進而影響了細菌的生長繁殖[5]。

變鏈菌生長繁殖和產酸代謝隨著外部環境p H值進一步降低,酸性進一步加強時,其生長受到的抑制影響表現就會越強。當p H值降至4．0、3．5時,越來越高的酸性環境已損傷兩種菌株的多種酶和細胞壁,其菌體生長都受到顯著抑制。

3 結論

變鏈菌標準株與LuxS缺陷株的耐酸性有一定差異,LuxS缺陷株相對于標準株,抵抗外部的低p H值環境能力有所下降。兩種菌株在耐酸反應方面都表現出了一定的適應性,也進一步表明了LuxS基因對于變鏈菌而言,對其生理功能和毒性調節方面具備比較大的影響作用,為后期繼續研究LuxS基因的其他相關功能以及發現齲齒防治的新方法打下良好的基礎。