茶樹菇B交配型位點結構分析

錢 蓉，陳衛民，柴紅梅，陶 南，趙永昌，陳玉惠

（1西南林業大學生命科學學院，昆明 650224；2云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，昆明 650221；3云南省農業生物技術重點實驗室，昆明 650223；4農業部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，昆明 650223）

0 引言

擔子菌中存在多種有性孢子，包括同核體和異核體，具有兩個或多個異核體萌發的菌絲體能完成正常的有性生殖過程，而同核體結實是一種比較異類的生殖方式，曾在多種擔子菌中此現象[1]，包括暗絨蓋多孔菌(Polyporus ciliatus)[2]，光滑環銹傘(Pholiota nameko)[3]，和裂褶菌(Schizophyllum commune)[4]等，金針菇(Flammulina velutipes)[5]產生的子實體多為流產型結實(Abortive homokaryotic fruiting,AHF)和真同核體結實(True homokaryotic fruiting,THF)，前者(AHF)子實體不開傘也不產生孢子，而后者(THF)產生的子實體發育完全但較小，孢子梗上多著生2個孢子。有趣的是茶樹菇(Agrocybe aegerita)中單核體能產生第3種子實體類型即假同核體結實(Pseudo homokaryotic fruiting,PHF)，其初生菌絲具鎖狀聯合，而且子實體發育完全，擔子上著生4種交配型的孢子[6]。由此可見，擔子菌產孢類型多變，容易混淆研究者對于物種遺傳模式的認識。

根據已有的遺傳模式研究，茶樹菇有性生殖遺傳分為兩種類型。（1）典型四極性異宗結合型：研究分析了歐洲和日本的野生菌株交配型后認為茶樹菇為多等位基因控制的四極性交配型[7-8]。（2）同核體交配極性轉換型：從茶樹菇中分離了4株野生型菌株子代，經鎖狀聯合觀察和交配極性測試，確認后的同核體菌株進行出菇分析，結果顯示同核體菌株能產生3種類型的子實 體 AHF(Abortive homokaryotic fruiting)、THF(True homokaryotic fruiting)和PHF(Pseudo-homokaryotic fruiting)型，其中PHF型子實體的后代中產生兩種新的交配型，后期的驗證表明單核體菌株中進行了自發的極性轉換[6]。單核體產生子實體的比例超過50%，個別菌株達到100%，THF和PHF的比率約為40%。經過子代交配型分析，研究者推斷茶樹菇交配極性轉換菌株中A和B交配位點分別有3個，其中2個為沉默表達位點[6]。當二者通過位點轉移轉移，交配基因具有活性時，就會出現新的交配極性。由此可見，茶樹菇單核體生殖是一種普遍現象，揭示其交配位點的基因結構組成及交配特征對于分析茶樹菇交配極性轉化具有重要的作用。

真菌的交配系統中，由單個遺傳因子A決定的稱為二極性交配系統，四極性交配系統則由不連鎖的A、B雙因子控制[11-12]。其中B因子編碼信息素及其受體，控制著鎖狀細胞的融合和核遷移過程[13-14]。信息素及其受體蛋白，通過細胞膜上的G-蛋白偶聯受體觸發細胞內的多個生化反應，進而完成整個的生活史[15-17]。多級聯的磷酸化反應最終將信號傳遞到末級的功能蛋白，控制著細胞融合等生理過程[18]。前期研究顯示茶樹菇近緣種楊柳田頭菇Agrocybe salicacola中B交配位點具有5個受體基因和2～3個信息素前體編碼基因，并且該位點被完整遺傳給子代[9]，該結果與前期研究中推測茶樹菇中具有3個B交配位點的結果不同。由于前期研究中，研究者僅對茶樹菇交配特點進行了系統研究，沒有從交配位點分子組成進行進一步闡述。因而，本研究擬以茶樹菇YSG菌株為研究材料，通過分離同核體菌株，進行基因組測序，驗證分析其B交配位點，結合子代同核體交配基因分布和交配型分析，為茶樹菇的有性生殖研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2017年9月—2018年10月在云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所進行。

1.2 試驗材料

實驗菌株茶樹菇YSG菌株來源于江西省農業科學院，菌株屬性見前文描述[10]。

1.3 同核菌株分離及菌株配對分析

單孢菌株分離采用孢子稀釋涂布法，挑取的菌株轉移到YPD培養基（酵母提取物2 g，蛋白胨2 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH值自然）上。培養2周根據菌落的整齊度初步篩選，選取邊緣整齊菌株進行顯微鏡觀察，并依據鎖狀結構判斷菌株是否為同核體。獲得的同核體菌株采用采用對峙培養的方法分析菌株交配極性。子實體形態切片后在顯微鏡下進行顯微形態觀察。

1.4 菌株培養及DNA提取

菌絲體置于YPD培養基上25℃培養2周后，刮取1 g菌絲液氮研磨后使用真菌DNA提取試劑盒(Biomega)提取基因組DNA。菌絲塊接到無菌的木屑培養基（木屑80%，麥麩19%，石灰1%），置于22℃培養，用于出菇觀察。

1.5 引物特征及PCR擴增

依據前期獲得YSG同核體子代菌株YS8基因組注釋結果，獲得B交配位點，根據序列特征設計引物，用于驗證序列。本試驗所用引物的合成及PCR產物序列測定均在昆明碩擎生物科技有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 YSG菌株子代同核出菇特征

同核體菌株接到木屑培養基后，進行了子代同核體出菇實驗，結果顯示，同核體能夠形成不同類型的子實體，包括菌絲型（只有濃密的菌絲）、無蓋型（無菌蓋）和菌柄型（經過顯微觀察，菌蓋不發育，不產生孢子）（圖1）。其中的無蓋型和菌柄型子實體在形成小的菇體后不再繼續生長，之后就被菌絲覆蓋后凋亡。

2.2 B交配位點結構組成分析

選擇YSG菌株子代同核體菌株YS8（交配型A1B1）進行基因組測序及組裝。根據基因組注釋信息，并設計5對嵌套引物YS8RCB1f/1r-YS8RCB5f/5r進行擴增，測序驗證B交配位點序列的準確性（表1）。結果顯示，YS8菌株的B交配位點分別被組裝到2個Scaffold上，包括4個完整的信息素受體和1個信息素前體編碼基因（圖2A）。

進一步的序列分析發現，以上2個Scaffold上靠近信息素受體基因B2-rcb2和B2-rcb4區域，分別有一個片段被注釋為信息素受體編碼基因，二者（分別命名為B2-rcb3a和B2-rcb3b）的下游和上游分別約有30 kb和20 kb以上的區域內沒有信息素受體基因存在。并且緊鄰區域部分序列反向互補（圖2B）。將2個片段拼接到一起后，能夠組成完整的信息素受體編碼基因（圖2C）。

2.3 同核體子代基因型及交配型分析

根據2個片段B2-rcb3a和B2-rcb3b序列，分別設計引物對P3af/r和P3bf/r（表2），用來分析同核體群體子代基因型。擴增結果現實，2對引物將所有的同核體菌株分為2種類型，并且二者的擴增譜相同（圖3A），推測連接B2-rcb3a和B2-rcb3b的大片段區域，在遺傳到子代的過程中沒有發生重組。

圖1 同核體菌株出菇特征

表1 YS8菌株B交配位點驗證及交配型鑒定引物特征

交配型分析結果顯示，所用的同核體菌株群體只有2種B交配型，分別為b1和b2型（圖2B）。交配型與B交配基因的基因型呈現完全對應關系，從而也進一步表明了B交配位點決定了菌株的交配型，并且該位點被完整分配到子代中。

3 討論

明確真菌的有性生殖模式和交配因子組成，對于其生殖遺傳研究、子實體發育，以及育種研究都具有重要意義。交配位點的基因組成決定了菌株的交配特點，探究真菌物種的有性生殖特征，需要明確其交配位點結構組成。有關B位點基因遺傳結構組成的研究較多，其組成也更為復雜，被認為是真菌在野生狀態下提高交配成功率的一種生存策略[12,19]。灰蓋鬼傘Coprinus cinereus B交配位點有3個基因簇，每個由3個基因組成，負責編碼2個信息素和1個受體[19]。隨著基因組學的廣泛應用，更多真菌的基因組得以快速解析。香菇Lentinula edodes B交配位點內有4個受體編碼基因及兩個信息素前體，并且在單核體中B位點結構基本一致[21-22]。金針菇包含有兩個亞位點，分別有一個信息素受體和1～2個信息素前體編碼基因[23]。草菇Volvariella volvacea中具有4個信息素受體編碼基因[24]，但其B交配位點可能沒有活性[25]。本研究中所確定的茶樹菇YSG菌株B交配位點包含有5個信息素受體和1個信息素前體編碼基因，與之前報道的近緣種楊柳田頭菇相似[9]。由此可見，在明確不同物種中交配基因的組成，以及多個信息素及受體在同核體菌株交配過程中的作用，才能探究交配極性轉換的機制。但是由于目前對交配基因功能的認識不足，因而對茶樹菇B位點結構組成的命名比較模糊，如亞位點的劃分只是根據信息素及其受體編碼基因簇的聚集度，即它們在基因組物理圖譜上的距離來進行，而不是依據其交配功能來劃分。茶樹菇B交配位點信息素和其受體在基因上距離較小，似乎只能認定為一個位點，判斷比較困難。以前報道中所認為的茶樹菇應有3個亞位點[6]，筆者建議這些亞位點應該描述為功能基因，即它們決定交配功能角色的轉變導致了新的交配極性的產生。另外，通過茶樹菇YSG同核體子代B交配位點和交配型分析，明確了其決定菌株交配型，并且在遺傳給子代的過程中，B位點內部沒有重組事件發生。該結果表明了該位點組成發生改變的幾率較小，即使如本研究中發現的大片段插入也沒有改變該位點整體遺傳到子代現象出現。在本研究中，分離了大量的同核體，培養結果只獲得了部分畸形（或不產孢型）子實體，而并未得到正常子產孢型實體，這與文獻報道中高比率產孢同核體相比明顯不同，結果的差異是否由于類群差異造成，由于茶樹菇類群較多[26-28]，還需要收集更多的資源，并根據類群劃分進行同核體出菇分析。

圖2 B交配位點結構特征

圖3 同核體子代B交配位點基因型及交配型

4 結論

茶樹菇YSG子代同核體培養后，部分菌株能產生子實體，但缺少菌蓋或有菌蓋但無擔子，即產生的畸形子實體沒有經過有性生殖過程。根據基因組序列，獲得了YSG子代同核體YS8菌株B交配位點信息，經嵌套PCR驗證確認B交配位點包含有5個信息素受體和一個信息素前體編碼基因。其中B2-rcb3基因序列中有一個大于50 kb的插入片段，該片段中有部分序列為反向重復。經過子代同核體PCR擴增譜分析，表明B交配位點，包括該大的插入片段并未在有性生殖過程中發生重組，而是完整的遺傳到子代中。交配極性分析結果顯示，群體中只有2種B交配型，24個菌株中沒有新的B交配型產生，并且也印證了B交配位點完整遺傳到子代的特征。這些結果與以前報道的茶樹菇交配極性轉換結果不同，有助于茶樹菇生殖遺傳多樣性及育種工作研究。