復方巖白菜素片有關物質HPLC方法的建立和研究

羅嫄，胡澤鍇

(成都市食品藥品檢驗研究院，四川 成都 610045)

復方巖白菜素片使用歷史悠久，為鎮咳祛痰藥，用于慢性支氣管炎，由巖白菜素和馬來酸氯苯那敏組成。其中巖白菜素為新疆虎耳草科植物厚葉巖白菜提煉精制得到的異香豆精類化合物，對慢性支氣管炎具有良好的鎮咳、祛痰效果，于處方中起主要作用[1-2]；馬來酸氯苯那敏為化學合成藥，作為抗組胺藥[3]可減輕呼吸道其他癥狀，起輔助作用。復方巖白菜素片最早收載于《中國藥典》1977年版(一部)[4]，現行標準為1989年出版的部頒藥品標準化學藥品及制劑第一冊[5]，這兩個標準中均未對有關物質進行控制。

在藥物的生產和儲存過程中會產生一定的降解產物，降解產物通常與不良反應息息相關，對藥物的安全性產生影響。在復方巖白菜素片多年的使用過程中，生產企業均收到數量不等的不良反應案例的反饋。研究其降解產物，控制好有關物質，保障其用藥安全是很有必要的。

查閱文獻及部分生產企業資料，復方巖白菜素片有關物質的相關研究并未見報道和提供。馬來酸氯苯那敏為化學合成藥，處方比例較低，其有關物質已有相關資料[3,6]；巖白菜素為植物提取物，處方比例較高，其有關物質無對應文獻資料，情況不明。為了保障藥品使用的安全性，本文就收集到的5個廠家的制劑及輔料，對復方巖白菜素片的有關物質做了一些探索性研究，最終建立了高效液相色譜(HPLC)檢查方法，對未知雜質進行限度檢查，并對樣品中的雜質總量進行了控制。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290高效液相色譜儀；梅特勒MS205DU電子天平(精度：十萬分之一)；島津AEG 220電子天平(精度：萬分之一)。

1.2 藥品與試劑 對照品：巖白菜素(中國食品藥品檢定研究院，批號：111532-201604，含量：94.1%)、馬來酸氯苯那敏(中檢院，批號：100047-201507，含量：99.7%)；試劑：甲醇(Fisher Chemical，純度99.9%)為色譜純，其余試劑為國產分析純。

復方巖白菜素片樣品，規格均為每片含巖白菜素125 mg和馬來酸氯苯那敏2 mg：貴州A藥廠3批，批號：180301、180905、190302；四川B藥廠3批，批號：180301、180701、190501；云南C藥廠2批，批號：180504、180806；湖南D藥廠2批，批號：180502、180908；云南E藥廠2批，批號：181101、181103。

輔料：玉米淀粉(濰坊盛泰藥業，批號：20180802)；淀粉(湘潭縣淀粉有限公司)；預膠化淀粉(湖州展望藥業，批號：201905010)；硬脂酸鎂(山東聊城阿華制藥，批號：20190332)；羥丙甲纖維素(湖州展望藥業，批號：20190204)；依地酸二鈉(湖南爾康制藥，批號：102320181204)；薄膜包衣劑(上海新菲爾生物制藥，批號：1904125S)；糊精(安徽山河藥用輔料，批號：190207)；羧甲淀粉鈉(西安北方惠安醫藥輔料，批號：180801)；滑石粉(廣西龍勝華美滑石開發有限公司)；微晶纖維素(湖州展望藥業)；蔗糖(云南德宏英茂糖業龍江糖廠，批號：190301)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Shiseido Capcell PAK C8(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動相：甲醇-水(16∶84)，檢測波長為215 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1，進樣量20 μL，等度洗脫，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍；供試品溶液如有雜質峰，按外標法以對照溶液峰面積計算雜質含量。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照溶液 精密稱取巖白菜素對照品約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇2 mL超聲使溶解，加流動相稀釋，搖勻，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加流動相稀釋，搖勻，制成每1 mL含巖白菜素0.01 mg的溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于巖白菜素50 mg)，置50 mL量瓶中，加甲醇10 mL超聲使溶解，加流動相稀釋并定容，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 空白對照溶液 根據各廠家提供的輔料種類和處方比例配制5個廠家的空白混合輔料，混勻后按照各個廠家配制供試品溶液所需稱樣量取樣，按“2.2.2”項下供試品溶液同法處理配制即得。

2.2.4 系統適用性溶液 稱取供試品細粉適量(約相當于巖白菜素10 mg)，加甲醇2 mL使溶解，加流動相稀釋并定容至10 mL，搖勻，制成每1 mL含巖白菜素1 mg的溶液，將此溶液置80 ℃水浴中加熱1 h，即得。

2.3 系統適用性試驗 取系統適用性溶液照“2.1”項下色譜條件進樣，巖白菜素與其前相鄰雜質峰的分離度為5.0(應不低于1.5)，理論板數為9 364(應不低于2 000)。取對照溶液、供試品溶液和空白溶液進樣，典型色譜圖見圖1～2(圖中主峰后無雜質峰出現，故只截取主峰前雜質放大)。

2.4 檢測限考察 用對照溶液逐步稀釋后進行檢測限考察，結果檢測限為0.040 μg·mL-1。

2.5 穩定性試驗 取供試品溶液進行穩定性考察，從2 h開始RRt=0.82的雜質峰明顯開始增大，表明供試品溶液穩定性較差，建議臨用新制。

2.6 破壞性試驗

2.6.1 破壞性試驗溶液的制備

2.6.1.1 酸破壞樣品溶液 稱取B藥廠190501批次供試品細粉(下同)適量(約含巖白菜素50 mg)，置50 mL量瓶中，加2 mol·L-1鹽酸溶液1 mL，放置1 h，再加入2 mol·L-1氫氧化鈉溶液1 mL，調pH為中性，照供試品溶液制備方法制備即得。

2.6.1.2 堿破壞樣品溶液 稱取供試品細粉適量(約含巖白菜素50 mg)，置50 mL量瓶中，加0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液1 mL，放置15 min，再加入0.2 mol·L-1鹽酸溶液1 mL，調pH為中性，照供試品溶液制備方法制備即得。

2.6.1.3 氧化破壞樣品溶液 稱取供試品細粉適量(約含巖白菜素50 mg)，置50 mL量瓶中，加30%過氧化氫溶液1 mL，放置1 h，照供試品溶液制備方法制備即得。

2.6.1.4 加熱破壞樣品溶液 稱取供試品細粉適量(約含巖白菜素50 mg)，置50 mL量瓶中，加甲醇10 mL振搖后加入適量流動相，于80 ℃水浴條件下加熱1 h，取出放冷至室溫，照供試品溶液制備方法制備即得。

2.6.1.5 光照破壞樣品溶液 稱取供試品細粉適量(約含巖白菜素50 mg)，置50 mL量瓶中，于4 500 Lx光照20 h，照供試品溶液制備方法制備即得。

2.6.2 破壞性試驗結果 將上述各種溶液照“2.1”項下色譜條件分別進樣。結果：復方巖白菜素片雜質較少，主要集中為相對保留時間為0.58、0.70和0.82的3個雜質，其中RRt=0.82的雜質在酸、加熱和光破壞條件下有增大趨勢，后二者較明顯；在堿破壞條件下有兩個新增雜質(RRt=0.19、0.92)，前者較為明顯，但在供試品中并無檢出；強制降解試驗提示樣品對堿、加熱和光照較其他條件敏感；在各破壞條件下的雜質峰之間及雜質峰與主峰之間均分離度良好；空白輔料均不干擾測定。強制降解樣品圖見圖3。

2.7 耐用性試驗 改變“2.1”項下色譜條件中的參數：甲醇比例(±2%)、柱溫(±3 ℃)、流速(±0.1 mL·min-1)、換用不同品牌的相同填料的色譜柱(Thermo C8柱4.6 mm×250 mm，5 μm)試驗，結果樣品中總雜質含量在0.08%～0.11%之間，說明方法耐用性良好，能滿足測定要求。

2.8 樣品測定 照“2.1.2”項下方法制備5個廠家共12批次樣品的供試品溶液，照“2.2”項下的色譜條件測定，記錄峰面積，按外標法計算雜質含量，結果見表1。

表1 樣品測定結果

3 討論

3.1 流動相的選擇 此處方組成中兩組分配方比例相差大(每片含巖白菜素125 mg和馬來酸氯苯那敏2 mg)，馬來酸氯苯那敏處方量低，對有關物質中雜質的貢獻量微小，而巖白菜素為植物提取物且無有關物質研究資料，故有關物質檢查主要針對巖白菜素。參考文獻[7-10]，篩選了不同色譜柱填料及流動相比例，最終確定此色譜條件下各雜質峰分離度較好，主峰保留時間適中。

3.2 檢測波長的選擇 采用PDA檢測器對雜質峰進行光譜掃描，最大單個雜質的最大吸收波長在215 nm，其他雜質在210～300 nm間吸收強度無明顯變化。同時，由于其他雜質含量過低無法通過掃描獲得紫外吸收光譜以確定最大吸收波長，故根據最大雜質的紫外吸收特征選擇了215 nm作為檢測波長。

3.3 采集時間的選擇 在此色譜條件下定位馬來酸氯苯那敏，其保留時間約為巖白菜素主峰的3倍，而供試品溶液濃度的馬來酸氯苯那敏色譜峰未檢出。鑒于強制降解實驗中在主峰之后基本無雜質峰出現，采集時間考慮將另一組分馬來酸氯苯那敏峰洗脫完畢為結束時間，即巖白菜素主峰保留時間的3倍。

3.4 溶劑的選擇 有資料顯示[3,11]，兩個組分的溶解性不同：巖白菜素在甲醇中溶解，在水或乙醇中微溶，而馬來酸氯苯那敏在水或乙醇中易溶。為降低溶劑效應，用流動相溶解樣品最為理想，但流動相中甲醇的比例較低，易造成巖白菜素溶解不完全，故本文采用先用少量甲醇溶解后再加流動相定容的方式來溶解樣品。

3.5 供試品溶液濃度的選擇 根據樣品中雜質的個數和含量，比較了1 mg·mL-1和2 mg·mL-1的供試品溶液濃度，發現二者雜質個數一致，最大雜質峰面積與供試品濃度不成倍數關系，其他雜質峰面積增大不明顯，故最終選擇1 mg·mL-1作為供試品溶液的濃度。

3.6 限度的制定 由12批次樣品的有關物質測定結果可以看出，最大單個雜質含量與總雜質含量相近，說明總雜質含量主要受最大單個雜質影響，其他未知雜質含量較低，故有關物質檢查項考慮只控制總雜質限度。根據此次的測定結果，初步將總雜質限度定為不得超過1.0%。在不同廠家和不同批次之間，最大雜質含量有高于或低于0.1%的現象，可能與不同廠家原料藥來源、制劑工藝、生產時間以及樣品儲存條件差異有關。