糖尿病相關hsa-miR-223-3p 靶基因預測及生物信息學分析

余夢娜，楊 標，仰禮真

1. 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院內分泌科，上海 200011；2. 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院神經外科，上海 200011

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種以高血糖為特征的常見代謝性疾病。據統計2015 年全球DM 患者已超過4.15 億，預計2030 年將達5.52 億[1]。DM 的發生過程受多種因素的影響，包括DM 病程、肥胖、遺傳等。若未能得到及時控制，患者將出現糖尿病性視網膜病變、腎病、心血管系統疾病等并發癥[2-3]。因此，探究DM 的發生機制、優化其治療策略對控制DM 病情進展十分必要。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種高度保守的非編碼小RNA，其可通過識別、特異性結合信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'非翻譯區（3'-untranslated region，3'-UTR）， 調 控mRNA 翻 譯。 研 究[4]顯 示，miRNA 參與了多種生物學過程的調控，包括細胞分化、增殖、凋亡，血管生成以及細胞周期等。有研究[5-6]發現hsa-miR-223 在DM 患者中的表達水平顯著低于健康人群，尤其是外周單個核細胞中，繼而推測hsa-miR-223 可能是DM 發生與發展過程中的潛在生物學靶標。本文擬通過生物信息學的方法預測DM 相關hsa-miR-223-3p 的靶基因，并尋找與DM 有關的生物標志物，以期為臨床診療中分子生物學靶點的選擇提供可靠的理論依據。

1 材料和方法

1.1 靶基因集獲取

以“（miR-223-3p） AND human disease”為 檢 索 詞，使 用PubMed（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/） 數據庫對已發表的hsa-miR-223-3p 相關文獻進行檢索，并發現該miRNA 在多種疾病中發揮作用，故將其作為研究對象。本研究將hsa-miR-223-3p 提交至starBase（version 2.0；http://starbase.sysu. edu.cn/）靶基因預測數據庫的miRNA-mRNA 這一導航欄中進行預測，篩選條件為：Program ≥2、CLIP-Data ≥0、low stringency。去除重復mRNA 之后，得到hsa-miR-223-3p 的靶基因集。

1.2 功能富集分析和信號通路分析

為研究hsa-miR-223-3p 及其靶基因潛在的生物功能及信號通路，將已獲得的靶基因上傳至DAVID（database for annotation，visualization and integrated discovery）（https://david.ncifcrf.gov/）數據庫行基因本體數據庫（Gene Ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）通路分析。同時，使用Reactome（https://www.reactome.org/）數據庫對靶基因進行通路研究。隨后，用R 語言的GOplot包對靶基因功能結果進行可視化繪圖。其中，GO 功能分析包括生物學過程 （biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組成成分（cell component，CC）。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

1.3 蛋白-蛋白相互作用網絡的構建和模型的選擇

為鑒別中樞基因并篩選模型，將靶基因集上傳至STRING（version 10.5；http://www.string-db.org/）數據庫進行在線分析，建立蛋白-蛋白相互作用（protein- protein interaction，PPI）網絡[7]，并通過Cytoscape 軟件（version 3.5.1；www.cytoscape.org）及Cytohubba 插件對PPI 網絡進行繪制。Cytohubba 插件共包含11 種分析參數，本研究以連接度（Degree）作為參數標準，對PPI 網絡中的區域進行連接度分析，篩選排名前30 位的中樞基因。同時，使用MCODE 插件篩選評分排名前3 位的子模塊，實現聚類結果的可視化。隨后，通過DAVID 數據庫對模塊中的中樞基因進行KEGG 通路分析，檢驗其通路富集情況。

1.4 DM 相關中樞基因的篩選

為進一步縮小hsa-miR-223-3p 靶基因的范圍并提高預測的準確性，將Cytohubba 插件獲得的中樞基因集與經KEGG 通路分析獲得的胰島素分泌通路涉及的基因集繪制Venn 圖，以篩選與DM 相關的中樞基因。

2 結果

2.1 Hsa-miR-223-3p 相關文獻檢索及其靶基因篩選

經PubMed 檢索后發現，hsa-miR-223-3p 在結腸癌[8]、腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）[9]、卵巢癌[10]、睪丸生殖細胞瘤（testicular germ cell tumor，TGCT）[11]等疾病中表達上調，在口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）[12]、骨肉瘤[13]等疾病中表達下調。此外，其還參與了肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）[14]、糖尿病腎病[15]、視網膜色素上皮炎性損傷[16]、脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）[17]、低氧損傷[18]、骨關節炎[19]等過程（表1）。隨后，采用starBase 靶基因預測數據庫的7 種算法中至少2 種算法同時預測基因與hsa-miR-223-3p 靶向結合，共得到1 094 個mRNA。去除重復基因后，最終獲得870 個靶基因。

表1 Hsa-miR-223-3p 靶基因參與部分疾病的發生與發展Tab 1 Hsa-miR-223-3p target genes involved in the occurrence and development of some diseases

Continued Tab

2.2 Hsa-miR-223-3p 靶基因的GO、KEGG 和Reactome分析

GO 功能分析顯示，hsa-miR-223-3p 靶基因主要存在于胞漿和核漿中，顯著富集于蛋白質結合、RNA 結合、連接酶活性等方面，參與RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的調節、細胞對胰島素刺激的反應、基因轉錄和翻譯的調控等過程（圖1）。KEGG 通路分析顯示，hsa-miR-223-3p 靶基因主要參與泛素介導的蛋白水解、癌癥的轉錄失調、減數分裂、甲狀腺激素信號傳導、胰島素分泌等通路（圖2）。 Reactome 通路分析顯示，hsa-miR-223-3p 靶基因主要富集在雌激素依賴型基因表達、人類免疫缺陷病毒蛋白R（Vpr）介導的前嵌合復合體入核、來源于無內含子轉錄本的成熟mRNA 的轉運等生物學反應中，其中排名前10 位的通路總結如表2。

表2 Hsa-miR-223-3p 靶基因富集排名前10 位的通路Tab 2 Top 10 pathways of hsa-miR-223-3p target genes enrichment

2.3 Hsa-miR-223-3p 靶基因的PPI 網絡構建及模塊分析

將預測得到的靶基因數據上傳到STRING 數據庫中，獲得靶基因對應的PPI 網絡。研究[20]顯示，2 個或2 個以上的蛋白質會通過非共價鍵形成蛋白復合體，且蛋白質之間的相互作用越多則該蛋白質越重要。利用STRING構建PPI 網絡后，將PPI 評分＞0.9 作為閾值條件，通過Cytohubba 插件篩選出連接度排名前30 的節點。由于第30 和第31 個節點的連接度均為21，故最終納入連接度≥21 的31 個節點為中樞基因。利用MCODE 插件篩選出PPI 中評分排名前3 位的子模塊（圖3），并通過DAVID數據庫對模塊中的中樞基因進行KEGG 通路分析，結果顯示模塊1 的靶基因主要富集于泛素介導的蛋白水解作用，模塊2 的靶基因主要參與RNA 轉運和細胞周期，模塊3 的靶基因主要參與內吞作用（表3）。

圖1 Hsa-miR-223-3p 靶基因的GO 功能分析Fig 1 GO function analysis of hsa-miR-223-3p target genes

圖2 Hsa-miR-223-3p 靶基因的KEGG 通路分析Fig 2 KEGG pathway analysis of hsa-miR-223-3p target genes

表3 排名前3 位的子模塊中中樞基因的KEGG 通路分析Tab 3 KEGG pathway analysis of hub genes in top 3 modules

2.4 DM 相關中樞基因的獲取

將Cytohubba 插件獲得的31 個中樞基因集和KEGG分析獲得的胰島素分泌通路中的基因集數據制作Venn 圖，得到兩者交集的靶基因為PRKACB（圖4）。因此，我們預測在DM 發病過程中，PRKACB 可能作為hsa-miR-223-3p 的靶基因對胰島素分泌通路發揮調控作用。

3 討論

DM 分子機制的識別對靶向診斷和治療十分重要。近年來有文獻報道顯示，miR-124a 和miR-96 可以調節胰島素分泌細胞相關蛋白的表達[21]；miR-133a 能誘導DM 患者發生心肌肥大[22]；miR-223 和miR-23a 在妊娠期DM 中可上調表達，并被認為是早期妊娠期DM 診斷的分子標志物[23]。上述結果表明，miRNA 不僅可作為疾病診斷、預后的分子指標，還可在臨床疾病靶向基因治療中發揮作用。既往研究顯示hsa-miR-223-3p 與多種疾病密切相關，因此我們猜測其可能參與了DM 的發病過程。

本研究通過starBase 靶基因預測庫建立了一個包含870 個hsa-miR-223-3p 靶基因的數據集。這些靶基因主要存在于胞漿和核漿中，在RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的調節、基因轉錄和翻譯、細胞對胰島素的應答等生物過程中發揮作用，同時還主要參與泛素介導的蛋白水解、減數分裂、甲狀腺激素信號傳導、胰島素分泌等通路。利用Cytohubba 插件篩選出連接度排名前31 的中樞基因，依次 為POLR2H、VHL、GAN、FBXW2、KLHL3、WSB1、FBXW7、KBTBD6、ASB6、ATG7、WWP1、FBXL14、CBLB、UBE2A、SIAH1、CDC23、CDC27、RNF213、HERC4、RNF4、UBR1、TRIM37、RNF220、RNF34、RNF217、UBE2W、SH3RF1、RANBP2、PRKACB、PAFAH1B1、NUP160。目前，已有學者探索了其中部分中樞基因與血糖及DM 間的聯系。例如有研究[24]發現，VHL 是維持第一時相胰島素分泌以及血糖穩態的調節因子之一。β 細胞中VHL 的缺失會激活缺氧誘導因子（hypoxiainducible factor，HIF），并使葡萄糖誘導的胰島素分泌能力受損，從而導致葡萄糖耐受不良[25]。FBXW7 可直接與胎球蛋白A 結合，誘導其泛素化和蛋白酶體降解，從而升高血糖，增加DM 的發生風險[26]。ASB6 作為胰島素受體信號復合體中的一分子，主要表達于脂肪細胞，其可通過使含PH 和SH2 結構域銜接蛋白（adapter protein with a pleckstrin homology and SH2 domain，APS）及其復合物泛素化，使APS 失去傳導胰島素信號的作用[27]。在DM 患者中，其ATG7 的表達水平較低使得由ATG7 介導的細胞自噬作用對胰島素的反應性下降，從而導致血糖維持較高的狀態[28]。WWP1 可能通過與腺苷酸活化蛋白激酶亞型2 （AMP-activated，α 2 catalytic subunit，AMPKa2） 的 相互作用下調其表達，參與胰島素抵抗，導致血糖升高[29]。CBLB 通過影響T 細胞激活途徑參與1 型DM 等自身免疫疾病[30]。DM 中高密度脂蛋白可通過上調參與HIF 穩定性的SIAH1 等關鍵調節因子，修復DM 中受損的血管新生能力[31]。然而在31 個中樞基因中，仍有許多靶基因與DM 的關系未被探索。如，FBWXW2 被證實能降解β-連環素，降低細胞遷移能力，且肺癌細胞的遷移和侵襲能力的提高均與FBWXW2 表達下調密切相關[32]，但尚未有文獻研究FBXW2 在DM 中的作用。

PRKACB 屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是cAMP 依賴性蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）的催化亞基之一[33]。PKA 可通過與cAMP 的相互作用調節信號傳導，參與細胞周期、細胞增殖和分化等細胞反應。目前，已有文獻就PRKACB 與miRNAs 之間的相互作用進行報道。在急性髓性白血病中，miR-496 的表達被抑制，而其靶基因PRKACB 的表達增加，從而促進細胞增殖并抑制細胞凋亡[34]；在肝癌中，miR-302-3p 通過抑制PRKACB 蛋白的表達，抑制類固醇受體輔助活化因子（steroid receptor coactivator，Src）和CREB（環磷腺苷反應元件結合蛋白）的磷酸化水平，從而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[35]；在阿爾茨海默病中，miR-200-3p 通過靶向PRKACB 抑制tau 蛋白的過磷酸化，發揮神經保護作用[33]；miR-200c 可直接作用于靶基因PRKACB，通過抑制cofilin 蛋白的磷酸化達到抑制癌細胞轉移的效果[36]。同時，PRKACB 還可通過其他方式參與到人類疾病中，如在肝外膽管癌中發現PRKACB 可與成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2）發生基因融合[37]。但有關PRKACB 與DM 之間的關系，仍尚未見報道。根據本研究獲得的Venn 圖，我們預測在DM 的發病過程中，hsa-miRNA-223-3p 的靶基因PRKACB 可能通過胰島素分泌通路發揮作用，未來其或可成為干預DM 病程發展的一個新靶點。由于本研究僅為初步預測，尚缺乏臨床標本和細胞實驗的驗證，就hsa-miR-223-3p 對靶基因的調控作用還需更深入的研究加以證實。

綜上，本研究通過生物信息學方法對hsa-miR-223-3p進行靶基因預測、GO 功能分析、KEGG 及Reactome 通路分析，結果顯示hsa-miR-223-3p 可能通過調控多個靶基因參與信號通路的調節，在機體的多種生理與病理過程中發揮重要作用；同時，我們初步預測hsa-miR-223-3p 可能通過PRKACB 調控胰島素分泌，對其進一步深入研究可為我們后續探索DM 發病機制及治療新靶點提供理論指導，還可為今后DM 的機制研究與治療提供更多新的思路。

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