亞甲基丁二酸在雄性C57BL/6J 小鼠體內半數致死量和半衰期的測定

郭陽陽 ，雷和花 ，王玉蘭

1. 中國科學院大學，北京100049；2. 中國科學院精密測量科學與技術創新研究院波譜與原子分子物理國家重點實驗室武漢磁共振中心，武漢430071；3. 新加坡表型中心，李光前醫學院，生命科學院，南洋理工大學，新加坡639646

亞甲基丁二酸（itaconic acid，ITA）又名衣康酸、甲叉琥珀酸，是一種不飽和二元有機酸，因其具有活潑的化學性質，是化學工業的重要原料[1]。目前，大多數的ITA 是由土壤真菌土曲霉發酵產生的[1]。在生物體內，ITA是由三羧酸循環的中間產物順烏頭酸經順烏頭酸脫羧酶（cis-aconiticacid decarboxylase，CAD）催 化 生 成[2]。在哺乳動物體內CAD 就是免疫應答基因-1 蛋白（immuneresponsive gene 1 protein，IRG1）[2]，IRG1 是哺乳動物體內一種重要的免疫蛋白，是免疫代謝中的關鍵成分，是產生ITA 的關鍵酶。已有研究[3]證明ITA 可以抑制細菌體內的乙醛酸循環中的異檸檬酸裂合酶而達到其抗菌的效果。ITA 在巨噬細胞的線粒體合成后，可以抑制琥珀酸脫氫酶的活性[4]。與此同時ITA 也可以分泌到胞漿中抑制KEAP1的活性，從而激活核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2），導致IFN γ 和IL-1β 的含量降低[4]，使機體的炎癥反應減輕。急性毒理實驗可以初步了解外源化學物質急性毒性強度，從而評價外源化學物質的安全性[5]。藥物半衰期（half-life）是外源性藥物在體內代謝的重要參考[6]。因此，本文測定了ITA 的半數致死量（half-lethal dose，LD50）來評價其安全性，同時測定了半衰期來作為ITA 在體內代謝的一個參數，為動物實驗給藥的劑量和時間提供重要的依據。

1 對象與方法

1.1 試劑與儀器

ITA 購于薩恩化學技術（上海）有限公司，生產批號BH290028；生理鹽水購于武漢濱湖雙鶴藥業有限責任公司，生產批號1905300801；HPLC 級別甲醇、甲酸、乙腈購于美國Thermo Fisher Scientific 公司，生產批號19045130。Agilent 6460 UPHLC-ESI-QqQ 儀器購于美國Agilent 公司。

1.2 實驗動物

8 周齡SPF 級C57BL/6J 小鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證編號SCKK（湘）2016-0002]，飼養于中國科學院精密測量科學與技術創新研究院小洪山園區SPF 級實驗動物中心動物房[實驗動物使用許可編號SYXK（鄂）2015-0051]。適應性飼養2 周，小鼠自由攝取食物和水。溫度21 ～25℃，濕度45%～70%，換氣次數30 ～50 次/h，光照/黑暗的自動切換時間12 h。半數致死量實驗中LD0和LD100組每組6 只小鼠，共分為7 組，LD50組每組12 只小鼠，共分為6 組。本研究經中國科學院精密測量科學與技術創新研究院倫理委員會 批準。

1.3 色譜質譜實驗

取50 μL 小 鼠 血 漿 樣 品，100 μL 甲 醇，50 μL 超 純水，混勻后離心取上清。上清液用0.45 μm 濾頭過濾至進樣瓶中。使用超高效液相色譜系統和QQQ 串聯質量分析器的Agilent 6460 三重四極桿系列采集數據，超高效液相色譜系統是配備了G4220A 二元泵和G4226 自動進樣器的Agilent 1290 系列。流動相A 是水+0.01%甲酸，流動相B 是乙腈。色譜柱使用Zorbax Eclipse Plus C18（1.8 μm，50 mm×2.1 mm）。色譜條件：流速0.25 mL/min；溫度40℃；進樣量 0.5 μL。質譜采用單離子檢測（single ion monitoring，SIM）負離子模式。

1.4 半衰期和半數致死量實驗

經尾靜脈將ITA 注射進小鼠體內。注射完成后開始計時，并于注射后0.5 h 和2 h 時采集小鼠眼底靜脈叢血液，4 ℃靜止4 h，取上清制成血漿樣品待測。小鼠經尾靜脈注射不同濃度的ITA 后連續觀察14 d 小鼠的狀態和存活情況并記錄，將記錄的數據采用SPSS 18.0 軟件計算得出半數致死量和半衰期。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 ITA LD50 的測定

ITA 經尾靜脈注射入C57BL/6J 雄性小鼠體內，觀察14 d 后小鼠的存活情況。通過注射5、50、500 mg/kg 的劑量確定受試濃度應該在50 ～500 mg/kg（表1）。隨后，通過注射100、200、300、400 mg/kg 的劑量確定合適的受試濃度應在200 ～400 mg/kg（表2）。最后，在合適濃度范圍內設置了5 個濃度進行實驗（表3）。

表1 ITA 對C57BL/6J 雄性小鼠的LD0 和LD100Tab 1 LD0 and LD100 of ITA in C56BL/6J male mice

表2 ITA 對C57BL/6J 雄性小鼠的LD0 和LD100Tab 2 LD0 and LD100 of ITA in C56BL/6J male mice

表3 ITA 對C57BL/6J 雄性小鼠的LD50Tab 3 LD50 of ITA in C56BL/6J male mice

根據以上數據利用SPSS 18.0 軟件計算出ITA 的LD50=258.263 mg/kg，95%CI 為（258.263±2.412） mg/kg。

2.2 ITA 半衰期的測定

ITA 經尾靜脈注射入小鼠體內，注射劑量根據之前LD50的結果，選擇100 mg/kg，分別于注射后0.5、2 h 眼底靜脈叢取約500 μL 的全血制成血漿待測。稱取1.000 0 g ITA 溶于超純水，梯度稀釋，依次配置濃度為0、0.001、0.002、0.01、0.1、0.2、0.5 μg/mL 的標準品溶液。標準溶液的色譜圖（圖1）和質譜圖（圖2）中，ITA 的峰形良好，無雜質被檢測到，濃度（x）和峰面積（y）線性回歸方程為y=53 055.467 880×x（R2=0.994 892 91）。共測定3只C57BL/6J 雄性10 周齡小鼠的ITA 半衰期（表4）。

圖1 ITA 的色譜圖結果Fig 1 Chromatographic results of ITA

圖2 ITA 濃度為0.02 μg/mL 的質譜圖結果Fig 2 Mass spectrum of ITA at 0.02 μg/mL

表4 ITA 在C57BL/6J 雄性小鼠體內的半衰期Tab 4 Half-life of ITA in C57BL/6J male mice

半衰期的計算公式為：

其中，t0、t1為采樣的2 個時間點，c0、c1為對應的濃度。

以上結果得出ITA 在C57BL/6J 小鼠體內的半衰期 t1/2=0.485 5 h =29.13 min，由此可見ITA 在 C57BL/6J 小鼠體內循環的半衰期很短。

3 討論

ITA 通過尾靜脈注射入小鼠體內之后，低劑量組別的小鼠沒有任何明顯的癥狀表現，達到致死劑量的小鼠出現呼吸加深、連續抽搐等癥狀，并在30 min 內死亡。根據本實驗的結果，ITA 在小鼠體內屬于代謝速率較高的一種藥物。如果要通過體外注射的方法來增加ITA 的濃度來研究其作用，需要頻繁給藥，從而使得多次操作刺激，增加實驗成本，實驗結果可信度降低。本實驗所用的ITA 的色譜質譜檢測方法，線性良好，無雜質被檢出，結果可信。ITA 作為一種具有抗炎效果的物質[3]，其抗炎的具體機制還沒有被完全闡明，本實驗的結果為今后ITA 的研究奠定了基礎。

本實驗條件下得出來的ITA 的LD50為258.263 mg/kg， 我國現行的急性毒性分級標準并沒有靜脈注射方式的標準，但是通過對比其他文獻[7]的結果，ITA 的LD50屬于較為安全的等級。在實驗中，小鼠的死亡都發生在注射后的30 min 內，按照標準的方法觀察14 d 未見小鼠繼續死亡[7]，由此可見ITA 的毒性會在很短的時間內發作。根據半衰期的長短，可將ITA 歸于超快速消除類（t1/2≤ 1 h），這類藥物一般不會在機體內大量蓄積，并且會很快被代謝或者排泄出體內[8]。超快速消除類藥物要達到作用的血藥濃度需要增加給藥次數或者使用靜脈滴注的方式給藥。當機體受到病原體入侵產生炎癥時，巨噬細胞在激活的狀態下產生ITA[9]，使得體內的ITA 能維持在一定水平。ITA可以由機體細胞產生，所以將來的研究可探索如何刺激體內的細胞產生更多的ITA。

參·考·文·獻

[1] Huang XN, Chen M, Li JJ, et al. Establishing an efficient gene-targeting system in an itaconic-acid producing Aspergillus terreus strain[J]. Biotechnol Lett, 2016, 38(9): 1603-1610.

[2] Campe R, Langenbach C, Leissing F, et al. ABC transporter PEN3/PDR8/ABCG36 interacts with calmodulin that, like PEN3, is required for Arabidopsis nonhost resistance[J]. New Phytol, 2016, 209(1): 294-306.

[3] Michelucci A, Cordes T, Ghelfi J, et al. Immune-responsive gene 1 protein links metabolism to immunity by catalyzing itaconic acid production[J]. PNAS, 2013, 110(19): 7820-7825.

[4] Kobayashi EH, Suzuki T, Funayama R, et al. Nrf2 suppresses macrophage inflammatory response by blocking proinflammatory cytokine transcription[J]. Nat Commun, 2016, 7: 11624.

[5] 李雪健, 張謙, 邢玉舒,等. 急性毒性實驗的研究進展及缺陷[C]// 中國藥物毒理學會.2017 年(第七屆)藥物毒理學年會論文集.山西.

[6] 李聯營. 試分析藥物半衰期與合理用藥[J]. 中國現代藥物應用, 2014, 8(7): 247-248.

[7] 李寅超, 王隨華, 郭琰, 等. 冬凌草二萜類成分半數致死量的測定[J]. 中國醫院藥學雜志, 2011, 31(2): 163-164.

[8] 李大猷. 青霉素靜脈滴注的藥物動力學及配伍禁忌[J]. 青海醫藥雜志, 1989, 19(1): 37-39.

[9] Strelko CL, Lu WY, Dufort FJ, et al. Itaconic acid is a mammalian metabolite induced during macrophage activation[J]. J Am Chem Soc, 2011, 133(41): 16386-16389.