低溫治療后不同復溫速率對心搏驟停復蘇大鼠神經元自噬的影響

李 藝，胡 月，孫大偉，崔德榮

上海交通大學附屬第六人民醫院麻醉科，上海 200233

心搏驟停發病率高，存活率低；且復蘇成功后，易遺留神經功能障礙，致殘率高[1]。心搏驟停患者自主循環恢復可造成腦缺血再灌注后6 h 內，鈣離子超載，大量炎癥因子、氧自由基和毒性神經遞質釋放，這是患者神經元損傷的主要原因。低溫治療被美國心臟協會推薦為心搏驟停患者自主循環恢復后的常規治療方法[2]。研究結果[3-4]表明，心搏驟停患者自主循環恢復后將患者溫度降至32 ～36 ℃并持續24 ～48 h，進而慢速復溫后，患者的神經功能預后與生存率顯著高于常溫組。其主要作用機制包括降低腦氧耗、減少炎癥因子釋放、抑制氧自由基生成、減少毒性神經遞質釋放等[5-6]。

低溫過程包括誘導期、維持期和復溫期，其中復溫期是低溫治療過程中最關鍵的環節。有研究[7]表明，低溫治療后慢速復溫可避免顱內壓增高；而快速復溫引起炎癥因子白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、IL-10 升高，逆轉低溫治療效果，降低生存率[7-9]。探索低溫治療后不同復溫速率所涉及的分子機制對減少低溫治療并發癥、改善患者預后、推廣低溫治療臨床應用具有重要意義。

既往研究[10-11]表明腦缺血再灌注可過度激活自噬，導致神經元死亡。自噬既是細胞的一種死亡機制，也是細胞的一種保護性機制[12]。自噬過程中自噬小體形成后，包裹待降解物質運送至溶酶體，溶酶體降解自噬小體，產生小分子代謝物，該過程也稱為自噬流。其中溶酶體起著重要的作用，其功能異常可導致多種疾病，如溶酶體儲存病等[13]。本課題組既往研究[14]結果表明，未經低溫治療的SD 大鼠腦缺血再灌注損傷后，氧自由基產生增加，自噬激活和溶酶體功能障礙，表現為溶酶體相關膜蛋白（lysosome-associated membrane protein 2，LAMP2）以及溶酶體水解酶組織蛋白酶D（cathepsin D）表達量降低、自噬流受損，導致神經元損傷。另有研究[10]表明，心搏驟停復蘇后的低溫治療可抑制自噬過度激活，對神經元產生保護性作用，但目前關于低溫治療過程中不同復溫速率所涉及的具體分子機制尚不明確。本研究旨在通過觀察自噬以及溶酶體功能在低溫治療后復溫過程中的變化，揭示該過程中所涉及的具體分子機制，從而改進低溫治療方案，為低溫臨床應用提供理論基礎，提高目標體溫管理治療在臨床上的使用率。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 實驗動物 雄性SPF 級SD 大鼠，2 ～3 月齡，體質量250 ～350 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（滬）2017-0005。大鼠飼養于上海交通大學附屬第六人民醫院實驗動物中心，實驗動物使用許可證號為SYXK （滬） 2011-0128。所有實驗動物操作流程符合上海交通大學附屬第六人民醫院倫理委員會相關規定。

1.1.2 實驗試劑和儀器 微管相關蛋白1 輕鏈3- Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3- Ⅱ，LC3- Ⅱ）抗體、P62 抗體、LAMP2 抗體、cathepsin D 抗體、熒光二抗Alexa Fluor?488 購自英國Abcam 公司，Beclin1（Bcl 2- interacting protein-1）抗體購自美國Santa Cruz 公司，泛素蛋白ubiquitin 抗體購自美國CST 公司，β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自中國杭州華安生物技術有限公司，化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑、RIPA蛋白裂解液購自美國Thermo Fisher 公司，Triton X-100 購自美國Sigma 公司，苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、鹽酸氯喹、尼式染色液、蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit）購自上海碧云天生物技術有限公司。亞低溫治療儀購自中國眾實迪創公司，鼠機械通氣儀購自美國哈佛儀器公司，化學發光成像儀（Image-Quant LAS 4000）購自美國GE 公司，倒置熒光顯微鏡（DM IL LED）購自德國Leica 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立 建立SD 大鼠窒息性心搏驟停復蘇模型，取SD 大鼠80 只，隨機分為假手術組（15 只）、常溫組（15 只）、慢速復溫組（30 只）和快速復溫組（20只）。使用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，進行左側股動脈、右側股靜脈置管和氣管插管，并連續監測大鼠肛門溫度和動脈血壓變化。假手術組同樣進行上述手術準備步驟，但無心搏驟停復蘇處理。常溫組、慢速復溫組、快速復溫組于右側股靜脈注射肌肉松弛劑羅庫溴銨（2 mg/kg），使自主呼吸停止持續5 min 且平均動脈壓下降至25 mmHg 以下持續2 ～3 min 后，立刻進行機械通氣、胸外心臟按壓并靜脈注射腎上腺素（100 μg/kg）。自主循環恢復后，常溫組使用加熱板，維持體溫（37.0±0.5） ℃；慢速復溫組和快速復溫組即刻進行34 ℃持續4 h 的低溫治療，低溫治療以及后續的復溫都是通過亞低溫治療儀進行，該設備可監測并自動調節直腸溫度至設定點。隨后，慢速復溫組以0.5 ℃ /h 復溫，快速復溫組以4 ℃ /h 復溫至（37.0±0.5） ℃。慢速復溫組和快速復溫組的SD 大鼠中各隨機選取5 只，作為慢速復溫氯喹組和快速復溫氯喹組，于建模前1 h 腹腔注射氯喹10 mg/kg。

1.2.2 尼式染色 用于尼氏染色的SD 大鼠，在低溫治療結束后24 h 取材，每組5 只。冰凍切片室溫放置30 min后，蒸餾水洗滌2 次（每次2 min），尼式染料滴于腦片上，于37 ℃孵育10 min 后，蒸餾水洗滌2 次，依次使用95%、70%乙醇脫水，二甲苯通透5 min，封片，顯微鏡下拍片。每只大鼠取3 張切片，每張切片在大腦皮質區域隨機取5個視野（400 倍鏡下），計算每個高倍鏡視野下活細胞數目。正常神經元的尼氏小體呈藍紫色，體積大而數量多，神經元受損時細胞皺縮，尼氏小體呈藍色，數量減少甚至消失。

1.2.3 Western blotting 蛋白檢測 假手術組、常溫組、快速復溫組于低溫治療結束后6 h 取材，每組5 只；慢速復溫組于低溫治療結束后6、12、24 h 取材，每個時間點5只。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，使用0.9%生理鹽水經心臟灌注，取出腦組織并置于冰上取下雙側運動皮層M1、M2 區。將取下的腦組織與PMSF、蛋白酶抑制劑混勻以后使用研磨器研磨。研磨物于4 ℃下12 000×g離心20 min，取上清液，使用BCA 法檢測蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目標蛋白后轉移至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PVDF 膜洗滌后加入抗P62（1:2 000）、抗Beclin1（1:2 000）、抗LC3- Ⅱ（1:3 000）、抗LAMP2（1:500）、抗cathepsin D（1:1 000）、抗ubiquitin（1:1 000）的一抗，于4 ℃搖床孵育過夜。次日，室溫二抗孵育1 h 后，于PVDF 膜上覆蓋化學發光顯影劑曝光。采用Image J 對免疫印跡條帶進行灰度值分析。

1.2.4 免疫熒光檢測 在低溫治療結束后12 h 取材，每組5 只。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，使用0.9%生理鹽水經心臟灌注，繼而用4%多聚甲醛持續灌注后取腦組織。置入濃度為20%～30%的蔗糖溶液依次梯度脫水后，浸泡于4%多聚甲醛固定24 h，于-80 ℃保存。使用OGD 包埋液包裹腦組織，于-20 ℃冰凍切片，厚度約20 μm，貼于載玻片上，置于-20 ℃保存備用。

將制備好的冰凍切片室溫放置30 min 后，磷酸鹽緩沖液洗滌10 min，重復3 次。5%胎牛血清室溫封閉1 h后，使用0.25% Triton X-100 室溫破膜10 min，隨后加入抗LAMP2（1:200）、抗LC3- Ⅱ（1:100）的一抗，4 ℃孵育過夜。次日，磷酸鹽緩沖液清洗，熒光二抗室溫孵育1 h，核酸染料4', 6-聯脒-2-苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）室溫10 min 染細胞核，于倒置熒光顯微鏡下觀察拍片。每只大鼠取3 張切片，每張切片在大腦皮質區域隨機取5 個視野（400 倍鏡下），觀察陽性蛋白的熒光強度。

1.3 統計學方法

應用SPSS 22.0、GraphPad Prism 7.0 以及Adobe Photoshop CC 2017 進行數據統計和圖形制作。定量資料以±s 表示，采用單因素方差分析，Bonferroni 檢驗進行兩兩比較。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同復溫速率對神經元活性的影響

為觀察窒息性心搏驟停復蘇低溫治療后，不同復溫速率對大鼠神經元活性的影響，使用尼氏染色檢測低溫治療結束后24 h 大鼠運動皮層神經元的改變。檢測結果（圖1） 顯示，快速復溫組運動皮層活細胞數為每個高倍鏡（×400）視野下（22.0±2.5）個，慢速復溫組為每個高倍鏡（×400）視野下（55.0±4.2）個，快速復溫組神經元活細胞數顯著低于慢速復溫組（P＜0.05），且與常溫組差異無統計學意義。

圖1 不同復溫組大鼠運動皮層尼式染色Fig 1 Nissl staining of rat motor cortex in different rewarming groups

2.2 慢速復溫對自噬的影響

為觀察復溫對自噬的影響，使用Western blotting 測定慢速復溫組低溫治療后6、12、24 h 的自噬激活標志蛋白LC3- Ⅱ與Beclin1 的蛋白表達量。結果（圖2A）顯示，與假手術組和常溫組比較，6 h 和12 h 后，LC3- Ⅱ以及Beclin1 水平增高。自噬選擇性底物受體P62，能夠識別待降解物，并將其運送到自噬溶酶體。P62 表達水平在6 h檢測到最低，且低于假手術組和常溫組。進一步使用免疫熒光法檢測細胞LC3- Ⅱ的表達情況，結果（圖2B）顯示慢速復溫過程中，LC3- Ⅱ陽性細胞計數較假手術組和常溫組顯著增加，以上結果表明在慢速復溫過程中自噬激活且自噬流通暢。

圖2 慢速復溫過程中自噬相關蛋白的表達情況Fig 2 Expression of autophagy associated proteins during slow rewarming

2.3 不同復溫速率對溶酶體功能的影響

為進一步觀察不同復溫速率對溶酶體功能的影響，我們檢測了不同復溫組低溫治療結束后6 h 溶酶體相關蛋白LAMP2 和cathepsin D 的表達水平。Western blotting 結果（圖3）顯示，與假手術組和慢速復溫組相比，常溫組和快速復溫組LAMP2 和cathepsin D 的表達水平降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），常溫組和快速復溫組蛋白表達量之間差異無統計學意義。使用免疫熒光法檢測溶酶體LAMP2 在皮質神經元中的表達，結果顯示，與慢速復溫組相比，快速復溫組LAMP2 陽性細胞率降低，與常溫組無明顯差異。以上結果說明低溫治療后快速復溫導致大腦皮質神經元溶酶體功能發生障礙，并且與常溫組無明顯 差異。

2.4 不同復溫速率對自噬流的影響

自噬受體蛋白P62 以及泛素蛋白ubiquitin 是反映自噬通量的關鍵蛋白。氯喹可抑制溶酶體水解酶活性，進而使自噬流受損，其常作為檢測自噬流受損的陽性對照物。對復溫組大鼠增加氯喹處理，可進一步觀察溶酶體功能障礙對慢速和快速復溫過程中自噬流的影響。結果（圖4）顯示，與慢速復溫組（未注射氯喹）相比較，慢速復溫氯喹組P62 和ubiquitin 表達水平在低溫治療結束后6 h 顯著增加，提示慢速復溫組自噬流通暢。但快速復溫氯喹組較快速復溫組（未注射氯喹），P62 和ubiquitin 表達水平顯著降低，表明快速復溫組溶酶體功能障礙且自噬流受損。

圖3 不同復溫組溶酶體相關蛋白的表達情況Fig 3 Expression of lysosomal-related proteins in different rewarming groups

圖4 不同復溫速率對自噬流的影響Fig 4 Effect of different rewarming rates on autophagy flux

3 討論

研究[3]表明，34 ～36 ℃持續24 h 的全身性低溫治療能顯著提高心搏驟停后心肺復蘇患者的存活率和改善神經功能預后。但對部分心搏驟停的患者，低溫對患者結局并無顯著效果，且由于低溫治療本身帶來的不良反應[15]，如心率減慢、血壓降低、凝血功能異常等，致使低溫治療在臨床上的使用率低。復溫是患者體溫從持續低溫治療恢復到常溫的過程，是低溫治療過程中的一個關鍵步驟。另有研究[8,16]報道，盡管低溫治療可改善患者心功能、神經功能及提高生存率，但復溫過程可誘導皮質神經元凋亡且快速復溫（2 ℃ /h）可逆轉低溫治療對心肌及腦組織的保護性作用。本研究結果也證實了這一現象，尼式染色結果提示快速復溫組活細胞計數顯著低于慢速復溫組。關于復溫階段，不同的溫度變異度對細胞生理功能如何產生影響，其中涉及的分子機制是什么，目前尚未闡明。

自噬是細胞內溶酶體對損傷的蛋白質和細胞器吞噬降解并釋放小分子物質供機體使用的過程。自噬過程包括自噬小體形成、自噬小體包裹待降解物運送至溶酶體、溶酶體與自噬體相結合、內容物降解及釋放的過程。其中Beclin1 作為上游信號分子調控自噬膜的形成；LC3- Ⅰ作為其下游信號分子，在形成雙層膜結構過程中與磷脂酰乙醇胺（PE）連接，形成LC3- Ⅱ，此標志著自噬的起始[17]。根據本課題組既往研究[14]，心搏驟停復蘇后未使用低溫治療的SD 大鼠溶酶體功能障礙自噬流受損，導致神經元的死亡，本研究進一步探索這一機制在腦缺血再灌注-低溫治療-復溫過程中所扮演的角色。結果顯示，慢速復溫組LC3- Ⅱ和Beclin1 均在低溫治療結束后6 h 升高，且在12 h 時仍顯著高于常溫組，同時伴隨自噬受體蛋白P62 的降低，提示復溫過程中自噬激活且自噬流通暢，推測低溫治療聯合慢速復溫對未使用低溫治療組的自噬流受損有修復作用，這一機制與低溫治療提高神經元活力相一致。

溶酶體在自噬過程中起到關鍵性作用，其功能的完整性對于自噬小體的降解至關重要[18]。研究[19]表明，溶酶體功能障礙導致溶酶體儲存病，引起機體一系列病理生理改變。溶酶體蛋白水解酶cathepsin D 的活性，反映著溶酶體的功能；溶酶體膜蛋白LAMP2 反映著溶酶體數量的多少[20]。本研究結果檢測到快速復溫組較慢速復溫組LAMP2 和cathepsin D 表達量均降低，提示快速復溫組溶酶體功能異常。這一生物事件的發生與快速復溫組神經元的死亡率增加相一致。由于快速和慢速復溫組之間的差異僅為復溫過程中溫度升高速率不同，推測低溫治療后的急劇溫度變化可能引起組織代謝和耗氧量增加，氧化應激加重，最終導致溶酶體功能障礙，神經元死亡。但目前復溫過程中相關的機制研究較少，確切的分子機制尚不明確。

在自噬過程中，泛素化待降解蛋白質是將其運送至溶酶體前的一個關鍵環節。泛素蛋白量的變化反映著自噬通量的變化。本研究中慢速復溫組使用氯喹抑制溶酶體蛋白水解酶活性，泛素蛋白及P62 進一步增加，提示自噬流通暢。而快速復溫組使用氯喹處理后，泛素蛋白及P62 表達水平未進一步增加，反而有下降的趨勢，提示自噬流受損。結合本研究中快速復溫組神經元損傷與常溫組之間差異無統計學意義，推測快速復溫過程中自噬流受損，逆轉了低溫治療的保護性作用。

低溫治療可降低細胞氧耗，減少氧化應激及炎癥因子產生，最終抑制腦缺血再灌注損傷。本研究結果發現低溫治療后的慢速復溫對于保持低溫治療的有效性至關重要，而快速復溫可逆轉低溫治療的效果；本研究還初步探討了快速復溫逆轉低溫治療效果的潛在機制，即溶酶體功能障礙，自噬流受損，為臨床上改進低溫治療措施、改善患者預后提供了理論基礎；但其涉及的其他分子機制還有待進一步研究。

參·考·文·獻

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