沉默Ttf1 對神經元細胞及雌性大鼠弓狀核內Kiss1 和GnRH基因表達的影響

臧少蓮，尹小琴，呂擁芬，許麗雅，郭 盛，李 嬪

上海交通大學附屬兒童醫院，上海市兒童醫院內分泌科，上海200333

青春期是生長和發育的關鍵時期，該階段的正常發育依賴于正常的神經內分泌功能。下丘腦-垂體-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG）軸調控人類的青春期發育和生殖功能，并且由興奮性和抑制性因子組成的復雜網絡嚴格調控，在胚胎期和嬰幼兒早期階段激活，在兒童期受到抑制，青春期開始時被重新激活并達到高潮[1]。促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）神經元的調控機制非常復雜，迄今為止關于青春期起始GnRH 神經元被激活的具體機制尚不清楚。親吻素（KISS1）是Kiss1 基因編碼產生的一種肽類激素，已有研究證實，KISS1 蛋白與G 蛋白偶聯受體54（G-protein-coupled receptor 54，GPR54）是調節GnRH神經元活性和青春期發育的關鍵調節因子[2]，主要分布在下丘腦的前腹側室旁核（anteroventral periventricular，AVPV）和弓狀核（arcuate nucleus，ARC）[3]。雌激素是調節雌鼠下丘腦Kiss1 表達的關鍵因子，在AVPV 中它通過激活表達KISS1 神經元上的雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα），正反饋促進GnRH 神經元分泌黃體生成素（luteinizing hormone，LH），刺激排卵；而在ARC中，雌激素則通過負反饋抑制KISS1 的釋放。ARC 和AVPV 共同作用產生LH 的脈沖式釋放，形成穩定的生殖 周期[4-5]。

甲狀腺轉錄因子1（thyroid transcription factor 1，TTF1），又稱為NK2 相關的同源轉錄因子1（NK2-related homeobox transcription factor 1，Nkx2-1）或甲狀腺特異性增強子結合蛋白（thyroid-specific enhancer-binding protein，T/ebp），主要在前腦、垂體、肺和甲狀腺等器官中表達[6]。Sandberg 等[7]研究發現TTF1 可以通過直接結合靶基因附近的調控元件而充當轉錄激活因子和抑制因子的角色。近年的研究[8]表明，TTF1 可能是Kiss1 上游的調控因子，通過直接調節Kiss1 的表達參與青春期性發育的調控。

敲除或敲低相關宿主基因對于研究細胞內關鍵分子的作用機制至關重要。慢病毒載體可以有效轉導細胞，并穩定整合到宿主基因組中并長期表達，是長期基因傳遞的良好載體，因此慢病毒載體介導的RNA 干擾（RNA interference，RNAi）仍然被廣泛使用[9]。為進一步證明TTF1 與青春期發育之間的關系，本研究設計并合成針對大鼠Ttf1 基因的干擾序列，構建有效慢病毒載體。在體外細胞水平測定慢病毒干擾效率后，進一步在體內利用腦立體定位技術將LV-TTF1-shRNA 原位注射至雌性大鼠下丘腦ARC 中，靶向敲低ARC 內Ttf1 的表達，觀察青春期性發育過程的變化以及對Kiss1 和GnRH 基因表達的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象及實驗材料

1.1.1 實驗動物及細胞 3 周齡的健康清潔級雌性Sprague-Dawley 大鼠（50 ～60 g）由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[生產許可證號為SCXK（滬）2017-0005]，隨機分為ARC 慢病毒注射組和ARC 病毒對照組，每組30 只。利用腦立體定位儀在大鼠ARC 內進行雙側顯微注射。實驗大鼠飼養于上海交通大學附屬第六人民醫院動物科學部[動物使用許可證號為SYXK（滬）2016-0020]，飼養條件為自然光照，平均溫度（21±2） ℃，相對濕度（55±10） %，12 h 明暗周期，大鼠自由攝食 飲水。

人胚腎細胞293T 為貼壁依賴型上皮樣細胞，神經母細胞ND7-23 為貼壁神經元細胞，2 株細胞均購自中國科學院細胞庫；常規培養使用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM 培養液（含4.0 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素），于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養。

1.1.2 主要試劑及儀器 內切酶、T4DNA 連接酶（1 U/μL）、DNA 標志物GeneRuler DNA Ladder、RNA 酶抑制劑（Fermentas，加拿大），TRIzol 試劑、反轉錄酶、DNA 聚合酶、dNTPs、轉染試劑Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國），凝膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒（Axygen，美國），包裝質粒、空病毒載體PDS019_pL_shRNA_F（上海諾百生物科技有限公司），DMEM、Opti-MEM、0.25%胰蛋白酶、FBS（Gibco，美國），氯仿、異丙醇、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司），DEPC 水、3-磷酸甘油 醛 脫 氫 酶（glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（上海翊圣生物科技有限公司），反轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）試劑盒（TaKaRa，日本），蛋白裂解液、ECL 發光試劑盒（ThermoFisher，美國），TTF1 抗體、KISS1 抗體（Abcam，英國），辣根過氧化物酶標記二抗（Jackson，美國），Western blotting 抗體快速剝離緩沖液（上海雅酶生物科技有限公司），戊巴比妥鈉（Sigma，美國）。

10 μL 微量注射器（上海高鴿工貿有限公司），低溫高速離心機（Eppendorf，德國），熒光顯微鏡（Leica，德國），實時熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士），紫外分光光度計（ThermoFisher，美國），ChemiScope 3500 化學發光成像儀（上海勤翔科學儀器有限公司）。DNA 測序和引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 LV-TTF1-shRNA 慢病毒載體的構建 對Ttf1 基因序列（NM_013093.1）進行分析，檢查基因內部有無特別復雜的二級結構和重復序列。然后采用Invitrogen 公司提供的在線設計工具（www.invitrogen.com/rnai）針對大鼠的Ttf1 基因設計3 對shRNA 引物序列（表1）。在序列的5'端添加限制性酶切位點及Kozak 序列GCCACC，在序列的3'端添加限制性酶切位點。將shRNA 引物混合溶液于95 ℃加熱5 min，72 ℃退火5 min 后利用DNA 連接酶連接入空載體PDS019_pL_shRNA_F 中。

1.2.2 慢病毒質粒的包裝 取對數生長期且細胞狀態良好的293T 細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后吹打形成單細胞懸液，按照6×106個細胞數接種到10 cm 的培養皿中，次日將細胞完全培養液換成5 mL Opti-MEM 培養液。將9 μg 包裝質粒和3 μg 慢病毒質粒加入1.5 mL Opti-MEM培養液中充分混勻；同時取36 μL Lipofectamine 2000 加入另外的1.5 mL Opti-MEM 培養液中，混勻后室溫放置20 min。將這2 種液體混合后加入細胞培養皿中，輕輕混勻，置于細胞培養箱中孵育6 h 后，換成完全培養液（含10%FBS），繼續培養48 h 后收集細胞培養液，1 000×g離心10 min，并用孔徑0.45 μm 的濾器進行過濾。將過濾后的病毒原液50 000×g 超速離心2 h，移去上清液，加入1 mL DMEM 培養液進行重懸，并利用熒光法測定病毒滴度，然后按需分裝至小管，置于-80 ℃冰箱中保存 備用。

1.2.3 LV-TTF1-shRNA 慢病毒轉染ND7-23 細胞 將ND7-23 細胞培養于含10%FBS 的DMEM 培養液中。梯度稀釋病毒原液后轉染ND7-23 細胞，利用熒光顯微鏡觀察不同病毒稀釋度轉染ND7-23 細胞后的增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）表達比例，從而確定慢病毒最佳轉染濃度。將細胞分成空白對照組、陰性對照組（NC 組）、LV-TTF1-shRNA1 組、LV-TTF1-shRNA2 組、LV-TTF1-shRNA3 組進行慢病毒轉染，37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，棄病毒液，加入完全培養液，繼續培養48 h，收集細胞沉淀用于qPCR 和Western blotting 檢測慢病毒的干擾效率。

1.2.4 下丘腦核團內雙側顯微注射 根據本課題組前期研究[10-11]，在大鼠21 日齡進行手術可使LV-TTF1-shRNA在青春期開始前達到最大表達量。將21 日齡雌性大鼠用1%戊巴比妥鈉（0.5 mL/100 g）深度麻醉后，置于腦立體定位儀上，切開皮膚和骨膜以暴露前囟點。采用10 μL 微量注射器進行顯微注射，并在其尖端再連接一段玻璃毛細管，以減小對大鼠腦部的損傷。將3 μL LV-TTF1-shRNA3慢病毒質粒（1.2×109TU/mL，LV 組）或LV-EGFP（即空病毒載體PDS019_pL_shRNA_F，NC 組）顯微注射到大鼠ARC 中。注射后，將針頭保留在原處5 ～10 min，然后在1 min 內緩慢取出，在對側核重復該操作。實驗過程中，參考Paxinos 等[12]的腦圖譜和前期研究結果[13-14]，確定ARC 的立體坐標（外側0.4 mm，前囟后1.6 mm，硬腦膜下9.6 mm）。術后于每日上午9:00—9:30 觀察大鼠陰門開啟情況。然后分別在大鼠幼年期（25 日齡）、青春發育早期（35 日齡）、成年期（42 日齡）腹腔注射過量的戊巴比妥鈉實施安樂死，斷頭取腦，迅速分離ARC 核團，并保存于液氮中，用于測定RNA 和蛋白的表達。

1.2.5 qPCR 檢測 使用TRIzol 試劑提取總RNA，利用紫外分光光度計檢測RNA 的濃度和純度。每個樣本取1 μg RNA 進行反轉錄（42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min）。qPCR 反應條件為95 ℃，3 min 變性；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，45 個循環。以β 肌動蛋白（β-actin）基因作為內參基因。各基因引物序列見表2。

1.2.6 Western blotting 檢測 利用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液提取細胞或組織中的蛋白質，BCA 法測定各組蛋白質濃度，加熱變性處理后進行Western blotting檢測。10%（用于TTF1）或12%（用于KISS1）SDSPAGE 進行半干電泳后轉移至PVDF 膜，轉膜條件為200 mA、70 min。5%脫脂牛奶封閉1 h 后加入抗TTF1 抗體（1:500）、抗KISS1 抗體（1:400）或抗GAPDH 抗體（1:10 000），4 ℃振蕩過夜；再加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1:10 000），室溫孵育1 h。用ECL 發光試劑盒進行化學發光檢測，經顯影處理后，膠片用凝膠成像分析系統拍照。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0 軟件進行統計分析，GraphPad Prism 8.0.1 軟件作圖。多組間均數比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并采用LSD 檢驗進行兩兩比較。P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒侵染ND7-23 細胞后TTF1 的表達

慢病毒轉染ND7-23 細胞72 h 后，在熒光顯微鏡下可見EGFP 表達（圖1），證明轉染成功。qPCR 結果（圖2A）顯示，NC 組與空白對照組相比，Ttf1 mRNA 表達差異無統計學意義。與NC 組相比，LV-TTF1-shRNA2 組和LV-TTF1-shRNA3 組Ttf1 mRNA 表達量顯著下降（均P=0.000），TTF1-shRNA2 和TTF1-shRNA3 的干擾效率分別為54.54%和64.24%。Western blotting 結果（圖2B）顯示：NC 組與空白對照組相比，TTF1 蛋白表達量差異無統計學意義；與NC 組相比，LV-TTF1-shRNA2 組和LV-TTF1-shRNA3 組TTF1 蛋白表達顯著降低（均P＜0.05），與PCR結果一致。根據對Ttf1 mRNA 和蛋白表達的抑制率，選擇干擾效率最佳的TTF1-shRNA3 構建慢病毒載體并包裝病毒，用于后續的動物體內下丘腦ARC 核團的注射。

圖1 LV-TTF1-shRNA 慢病毒質粒轉染ND7-23 細胞（×100）Fig 1 Transfection of ND7-23 cells with LV-TTF1-shRNA plasmid (×100)

圖2 慢病毒質粒轉染ND7-23 細胞72 h 后Ttf1 mRNA 和蛋白的表達量 Fig 2 Expressions of Ttf1 mRNA and protein 72 h after transfection of lentiviral plasmids in ND7-23 cells

2.2 LV-TTF1-shRNA3 慢病毒質粒侵染ND7-23 細胞后Kiss1 和GnRH 的表達

LV-TTF1-shRNA3 慢病毒質粒轉染ND7-23 細胞72 h后，qPCR 結果（圖3）顯示：NC 組與空白對照組比較，Kiss1 和GnRH mRNA 表達差異無統計學意義；與NC 組相比，LV-TTF1-shRNA3 組的Kiss1 和GnRH mRNA 表達顯著降低（均P＜0.05）。

2.3 慢病毒質粒在大鼠ARC 核團的原位注射

參考Paxinos 等[12]的腦圖譜，利用腦立體定位注射儀，先通過注射藍墨水確定ARC 核團位置（圖4A、B），然后在雙側ARC 內顯微注射LV-EGFP。雌鼠25 日齡時通過熒光顯微鏡在ARC 內觀察到高密度表達EGFP 的細胞（圖4C、D），在注射通道中也觀察到一些少量的EGFP 表達。

圖3 LV-TTF1-shRNA3 轉 染ND7-23 細 胞72 h 后Kiss1 和GnRH mRNA 的 表達Fig 3 mRNA expressions of Kiss1 and GnRH in ND7-23 cells 72 h after LV-TTF1-shRNA3 transfection

圖4 LV-EGFP 在大鼠下丘腦ARC 內的定位及表達Fig 4 Location and expression of LV-EGFP in the ARC in hypothalamus after LV-EGFP injection in the rats

2.4 大 鼠ARC 內 注 射LV-TTF1-shRNA3 后 對Kiss1 和GnRH 基因表達的影響

對21 日齡的雌性大鼠ARC 核團原位注射LV-TTF1-shRNA3 或LV-EGFP 后，分別于25 日齡、35 日齡、42 日 齡處死大鼠，分離ARC 核團。通過qPCR 檢測大鼠ARC中Ttf1、Kiss1、GnRH mRNA 的 表 達。Ttf1 mRNA 在ARC 中顯著降低（均P=0.000，圖5A），Kiss1 和GnRH mRNA 也 顯 著 降 低（均P＜0.05，圖5B、C）。Western blotting 結果與qPCR 結果一致，在3 個不同發育階段，LV 組的TTF1 蛋白表達顯著降低，與NC 組相比，35 日齡和42 日齡時，LV 組KISS1 蛋白表達顯著下降（均P＜0.05，圖5D～F）。

2.5 大鼠ARC 內注射LV-TTF1-shRNA3 后對性發育的影響

21 日齡雌性大鼠ARC 內注射LV-TTF1-shRNA3 后，陰門開啟時間較NC 組明顯延遲（P=0.000，圖6）。

圖5 ARC 內注射LV-TTF1-shRNA3 后對Kiss1 和GnRH 表達的影響Fig 5 Effect of intra-ARC LV-TTF1-shRNA3 administration on the expressions of Kiss1 and GnRH

圖6 ARC 內注射LV-TTF1-shRNA3 后對雌性大鼠青春期發育的影響（n=7）Fig 6 Effect of intra-ARC LV-TTF1-shRNA3 administration on female rat puberty (n=7)

3 討論

2001 年，Lee 等[15]研究發現，中樞性性早熟會使得下丘腦病變部位附近的神經元TTF1 表達量增加。先前，Kimura 等[6]就發現，攜帶Ttf1 基因失活突變的小鼠下丘腦腹內側核和背側核發育停滯，第三腦室腹側發生融合，缺乏弓狀核。在哺乳動物青春期啟動之前，下丘腦中Ttf1 mRNA 的表達會隨著發育逐漸增加[15]。Kim 等[16]的研究發現，大鼠在26 ～27 日齡，即青春期啟動之前，TTF1的表達會達到一個明顯的峰值。這些研究結果表明TTF1不僅參與哺乳動物的青春期發育，還與下丘腦神經核團的發育密不可分，更加支持了TTF1 是由中樞控制青春期啟動的重要成分。

本研究使用的ND7-23 細胞能夠表達內源性TTF1，是研究TTF1 調控Kiss1 的良好體外模型。體外實驗證實，在ND7-23 細胞內下調Ttf1 可以降低細胞內Kiss1 和GnRH 基因的表達。進而通過腦立體定位儀將LV-TTF1-shRNA 慢病毒質粒原位注射到21 日齡雌性大鼠下丘腦ARC 內，在青春期啟動之前特異性干擾核團內Ttf1 的表達，觀察其對雌鼠青春期發育的影響。手術完成4 d 后，通過冰凍切片，可以明顯觀察到ARC 內有EGFP 表達。腦立體定位注射將慢病毒質粒傳遞到細胞或哺乳動物體內，可使得目的片段在特定位置穩定并持續地表達；并且TTF1-shRNA 可以在雌鼠青春期內持續發揮干擾作用，且抑制Ttf1 表達后，不僅使得Kiss1 和GnRH 基因表達顯著下調，而且也導致雌鼠陰門開放時間明顯延遲。雖然前期有研究者使用Cre/Loxp 技術構建小鼠分化神經元內的Ttf1基因敲除動物模型[17]，小鼠也出現了青春發育延遲，但是Cre/Loxp 技術時間和價格成本較高，且胚胎期小鼠不易存活。因此我們通過腦立體定位注射慢病毒來研究Ttf1 對雌鼠青春期發育的影響及其分子機制，與體外實驗結果一致，這也表明利用慢病毒載體持續沉默靶基因是一種研究影響青春期發育因素的有效方法。

綜上所述，抑制下丘腦ARC 中Ttf1 的表達可以引起啟動HPG 軸Kiss1 的表達減少和GnRH mRNA 的降低，從而延遲雌鼠陰門開放時間。TTF1 在青春期發育過程中起著重要的作用，本研究可能為兒童性早熟的治療提供新的理論依據。

參·考·文·獻

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