小飛蓬捕光葉綠素結(jié)合蛋白基因CcLhca-J9克隆及表達分析

李祖任，羅丁峰，柏浩東，徐晶晶，韓進財，徐強，王若仲，柏連陽,?

1湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜草生物學(xué)及安全防控生物學(xué)湖南省重點實驗室，長沙 410125；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室，長沙 410128

0 引言

【研究意義】小飛蓬（Conyza canadensis）為菊科（Asteraceae）飛蓬屬（Conyza）的一種具較強繁殖和環(huán)境適應(yīng)能力的入侵雜草，主要分布于果、桑、茶園、草坪和荒地[1]。小飛蓬已對草甘膦、草銨膦、莠去津等多種化學(xué)除草劑產(chǎn)生不同程度的抗藥性，例如浙江寧波的兩個抗草甘膦種群抗性指數(shù)分別達8.28和7.92[2-3]。據(jù)報道，當(dāng)小飛蓬1 m2發(fā)生數(shù)為72株時，油菜角果數(shù)、角果籽粒數(shù)顯著下降，產(chǎn)量下降達35.93%，可見惡性雜草小飛蓬給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來較大的經(jīng)濟損失[4]。植物化感物質(zhì)的挖掘和利用是開發(fā)植物源除草劑的有效途徑，是治理小飛蓬等抗藥性雜草的熱點方向之一[5]。發(fā)掘新穎生物源化合物結(jié)構(gòu)、除草作用機制和靶標(biāo)，闡明活性化合物與雜草相互作用機制，利用生物除草關(guān)鍵基因資源，可最終克服生物除草劑產(chǎn)品發(fā)展的成本與環(huán)境制約因素[6]。【前人研究進展】目前，以天然產(chǎn)物為基礎(chǔ)研發(fā)的生物除草劑的作用機制主要有五大類，但是許多天然產(chǎn)物的抑草作用靶點和分子機制仍然是未知的[7]。光合系統(tǒng)是除草劑作用的重要靶標(biāo)之一，其中光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II是吡啶類和三嗪酮類除草劑的靶標(biāo)[8]。鏈霉菌（Streptomycesspp.）產(chǎn)生的多肽L-phosphinothricin抑制谷氨酰胺合成酶，鏈格孢菌（Alternari alternata）產(chǎn)生的細交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）阻斷光合系統(tǒng) II[9-10]。上述抑草靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)，為生物除草劑的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。羊脂酸分子式為C8H16O2，油狀液體不溶于水，屬于有機酸類化合物，主要用于染料、防腐劑、殺菌劑[11]。筆者所在課題組前期從椰子中分離提取出羊脂酸，并驗證其為一種具有廣譜、高效抑草活性的植物源化合物，具有開發(fā)成為植物源除草劑的潛力[12]。采用透射電鏡技術(shù)觀察到羊脂酸處理小飛蓬葉片后，葉綠體和線粒體結(jié)構(gòu)隨著作用時間的延長出現(xiàn)了空腔、裂解的現(xiàn)象[13]。采用 Lable-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析羊脂酸處理小飛蓬葉片，發(fā)現(xiàn)LHC蛋白（UniProt ID：A0A103Y9J9）響應(yīng)了羊脂酸處理，并與光合指標(biāo)測定結(jié)果相一致，但該蛋白是否為羊脂酸抑制小飛蓬的靶標(biāo)蛋白仍需進一步研究[14]。捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白（light harvesting chlorophyll a/b-binding protein，LHC）是光系統(tǒng) I和光系統(tǒng) II中獲取光能并將其傳送至光反應(yīng)中心的色素蛋白復(fù)合體[15]。在高等植物體內(nèi)，編碼LHC（LHCI、LHCII）蛋白是一個多基因家族，定位于細胞核內(nèi)；LHCI蛋白由Lhcal、Lhca2、Lhca3和Lhca4基因編碼，LHCII蛋白由Lhcbl、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5和Lhcb6基因編碼[16]。隨著分子克隆和基因測序技術(shù)的發(fā)展，部分植物的LHC蛋白基因已被克隆出來，例如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、橡膠樹（Hevea brasiliensis）、秈稻9311（Oryza sativa）[17-19]。【本研究切入點】目前的研究大部分集中在各植物 LHC蛋白及其基因的表達差異、功能解析等，對于LHC蛋白與抑草活性脅迫相關(guān)的功能解析研究較少[20]。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過分子克隆和生物信息學(xué)等技術(shù)全面闡釋小飛蓬捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因（CcLhca-J9）的分子特征，解析羊脂酸處理下該基因表達的特殊性，預(yù)測羊脂酸作用LHC蛋白的關(guān)鍵位點，為后續(xù)基因功能驗證打下基礎(chǔ)，同時為植物源羊脂酸產(chǎn)品研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小飛蓬種子2018年9月采集于湖南省長沙市芙蓉區(qū)湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)荒地并保存于種子超干低濕存儲柜（購于北京明日百傲生物科技有限公司），選出飽滿種子用0.4%赤霉素溶液催芽后，挑選吐白的種子移入塑料盆缽（內(nèi)徑20 cm），置于光照培養(yǎng)箱（8 h黑暗、溫度 18℃/16 h光照、光強 100—120 μmol·m-2·s-1、溫度 20℃）培養(yǎng)至三葉期待用。羊脂酸（純度99%）采用蒸餾萃取法自制，具體制備方法參考文獻[12]。

1.2 CcLhca-J9的克隆

從NCBI中選擇保守性高的Lhca基因同源序列設(shè)計簡并引物CcJ9-1（表1），進行PCR擴增獲取目的基因片段。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，70℃延伸30 s，循環(huán)30次；70℃延伸7 min。凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠回收純化目的片段，連接到pCambia2301載體，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α（購于南京諾唯贊生物科技有限公司），挑取陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序[17]。根據(jù)已知目的片段設(shè)計5′和3′ RACE特異引物（表1），采用TaKaRa公司Clonetech SMARTer RACE 5′/3′ Kit擴增試劑盒說明擴增。獲得Lhca的 5′ RACE序列、核心序列及3′ RACE序列，根據(jù)三者拼接后序列設(shè)計引物（表1）確定CcLhca-J9全長。

1.3 生物信息學(xué)分析

采用DNAMAN分析核酸序列并檢測編碼氨基酸序列，ExPaSy在線預(yù)測分子量和等電點（molecular weight/isoelectric point，MW/pI），在 NCBI中搜索LHC的高相似度氨基酸序列，選取19個典型的植物蛋白，先用ClustalX軟件多序列比對，再用MEGA 4.1軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建進化樹[21]。利用 SWISS-MODEL在線搜索與選擇模板，再通過Swiss-PdbViewer軟件優(yōu)化模型結(jié)構(gòu)[22]。

1.4 分子對接

采用上一步 LHC同源建模結(jié)果作為模型來尋找羊脂酸與LHCI-J9蛋白的對接方式。在AutoDock 4.2軟件上運行，電荷計算采用 RESP（Restrained electrostatic potential）法；活性位點采用AutoGrid格式點搜索，網(wǎng)格大小為60?×40?×60?，格點間隔為1.0?。中心設(shè)定為配體在LHC中的質(zhì)心；采用LGA（Lamarckian genetic algorithm）法計算配體與受體間的自由能，其余參數(shù)均為缺省值[23]。在最終得到的10個最優(yōu)構(gòu)象中，選取能量值最低的構(gòu)象作為進一步研究對象。

表1 CcLhca-J9克隆及實時熒光定量PCR表達引物Table 1 The primers used for CcLhca-J9 cloning and RT-qPCR

1.5 CcLhca-J9響應(yīng)羊脂酸的表達分析

用羊脂酸（625 μmol·L-1）、阿魏酸（625 μmol·L-1）和清水對照各10 μL，兌水10 mL，噴霧處理小飛蓬葉片0、0.5、1、2、4、8 h后，收集新鮮葉片立即置于液氮。參照 Trizol改良法提取小飛蓬葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。RT-qPCR反應(yīng)體系 20 μL：SYBR Premix ExTaqTM10 μL、引物（R和 F）0.5 μL、cDNA 5 μL、ddH2O 4 μL。反應(yīng)程序：95℃ 30 s，58℃ 20 s，循環(huán)40 次。所用引物為目的基因特異性引物qR-J9和內(nèi)參基因Actin引物（表1）。數(shù)據(jù)處理運用 2-ΔΔCT法，比較目的基因的表達水平[24]。利用SPSS軟件中Duncan氏新復(fù)極差法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 CcLhcIa-J9序列的獲得

以反轉(zhuǎn)錄未施藥的小飛蓬葉片cDNA為模板，用簡并引物CcJ9-1進行PCR擴增、回收和測序，獲得CcLhca-J9核心序列483 bp（圖1-A）。用引物Cc-F2、Cc-R2、Cc-R3、Cc-F3和Cc-F4進行三輪PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)回收和測序，獲得cDNA 5′端序列428 bp和3′端序列253 bp（圖1-B）。將5′ RACE序列、核心序列及 3′ RACE序列用 DNAMAN 軟件拼接，獲得CcLhca-J9cDNA序列全長（圖2）。

2.2 CcLhcIa-J9生物信息學(xué)分析

經(jīng)同源克隆和 RACE克隆，獲得了CcLhca-J9的全長cDNA序列，該基因閱讀框長744 bp，編碼247個氨基酸（圖2）。編碼蛋白分子質(zhì)量為26.766 kD，理論等電點為6.43；該蛋白中25個丙氨酸，占總數(shù)的 10.1%；其次是脯氨酸和甘氨酸，分別為 24和23個，各占9.7%和9.3%。CcLhca-J9蛋白保守區(qū)預(yù)測顯示，該蛋白屬于Chloroa_b-bind家族，具有典型的捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白功能（圖3）。系統(tǒng)進化結(jié)果表明，不同物種來源的Lhca蛋白在分屬不同分支，CcLhca-J9蛋白與除蟲菊（GEW73959.1，Tanacetum cinerariifolium）和黃花蒿（PWA35049.1，Artemisia annua）Lhca蛋白進化程度最為接近，同處于菊科這一分支（圖4）。預(yù)測二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，蛋白具有螺旋（Hh）97個，占39.27%；β轉(zhuǎn)角（Tt）7個，占2.83%；延伸鏈（Ee）9個，占3.64%；無規(guī)則卷曲（Cc）134個，占54.25%（圖5）。LHC-J9蛋白以4y28.1.O（2.80?）為模板進行同源建模，序列相似度為 89.9%，高度同源結(jié)構(gòu)，GEQE=0.75，QMEAN=-2.20，可見所獲得的模型質(zhì)量是較為可靠的。CcLhca-J9蛋白是單分子物體，具有6個葉綠體a配體，是一個典型的捕光復(fù)合物I葉綠素a/b結(jié)合蛋白（圖6）。

2.3 分子對接

分子對接的計算結(jié)果顯示（圖 7），羊脂酸與CcLhca-J9蛋白形成氫鍵和p-π的作用力共同影響了兩者之間的結(jié)合，其結(jié)合能量為-20.9 kJ·mol-1。羊脂酸的羰基氧原子與 Gly68氨基酸殘基形成氫鍵，鍵長為2.9?；Phe67和Phe69中氮原子與羊脂酸的碳氧雙鍵形成p-π，距離均為3.1?；羊脂酸的羥基氫原子與Arg197氨基酸殘基形成氫鍵，鍵長為 2.4?；羊脂酸的羥基氧原子與Arg197氨基酸殘基形成p-π，鍵長為3.3?。

2.4 羊脂酸處理對CcLhca-J9 表達的影響

RT-qPCR結(jié)果表明，在羊脂酸處理小飛蓬葉片后0—8 h，CcLhca-J9表達量明顯下降。羊脂酸處理后0.5—1 h，CcLhca-J9的表達量與清水對照相比下降了66.01%；羊脂酸處理后2 h，CcLhca-J9的表達量緩慢下降，與對照相比下降了 82.72%；4—8 h 后，CcLhca-J9的表達量趨于穩(wěn)定，與對照相比下降 92%—93%（圖8）。羊脂酸處理后，CcLhca-J9表達量與對照相比呈下調(diào)趨勢，此結(jié)果與前期蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。清水對照和另一有機酸類化合物阿魏酸處理小飛蓬葉片，CcLhca-J9表達量總體未出現(xiàn)顯著變化。

3 討論

植物L(fēng)HC蛋白家族基因是細胞核內(nèi)的光合系統(tǒng)基因，其編碼的蛋白與色素形成的復(fù)合物能捕獲光能并傳遞能量至光化學(xué)反應(yīng)中心[16]。本研究采用RACE技術(shù)克隆獲得小飛蓬葉片LHC蛋白家族基因成員CcLhca-J9cDNA序列，其OFR全長為744 bp，編碼247個氨基酸，分子量為26.766 kD，理論等電點為6.43；二級結(jié)構(gòu)具有螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈、無規(guī)則卷曲；以4y28.1.O（2.80?）為模板進行同源建模，三級結(jié)構(gòu)是單分子物體，具有6個葉綠體a配體，是一個典型的捕光復(fù)合物I葉綠素a/b結(jié)合蛋白。系統(tǒng)進化分析表明，與除蟲菊和黃花蒿L(fēng)hca蛋白進化程度最為接近，同處于菊科這一分支，一致性超過85%，表明該基因家族保守性較強。比對已報道的植物L(fēng)HC蛋白，發(fā)現(xiàn)它們均無信號肽，存在跨膜區(qū)，含有結(jié)構(gòu)功能域，為親水性非分泌蛋白[25-26]。

植物L(fēng)HC表達與抗逆性密切相關(guān)。YANG等[27]研究表明，與野生型相比，稀脈浮萍（Lemna perpusilla）的細胞色素b6f突變體在低光強下可維持LHC II在一個恒定的低水平上；李真等[28]研究發(fā)現(xiàn)，東南景天（Sedum alfredii）的SaLhcb2在鎘、銅、鉛處理后，根、莖、葉中表達量相比對照均發(fā)生顯著上調(diào)或者降低；YANG等[29]研究發(fā)現(xiàn)，菠菜（Spinacia oleracea）N-端LHCII可識別蛋白降解酶，通過降解LHCII的含量可達到響應(yīng)不同光強。本研究qPCR結(jié)果顯示，羊脂酸脅迫處理小飛蓬葉片后，CcLhca-J9的表達量在處理后0—8 h隨時間延長表現(xiàn)出下降的趨勢。與對照清水和阿魏酸處理相比，羊脂酸抑制CcLhca-J9的表達存在著一定的特異性，預(yù)示著LHC可作為抑草靶標(biāo)用來開發(fā)除草劑。

植物L(fēng)HC是一類潛在的植物源除草劑作用靶標(biāo)。光合作用抑制劑的開發(fā)一直是農(nóng)藥學(xué)家創(chuàng)制新型除草劑的熱門方向，但是建立在充分研究受體蛋白結(jié)構(gòu)與抑制劑相互作用的前提下[30]。去草凈（terburyn）是一種典型三嗪類 PSII抑制劑，與 D1蛋白氨基酸殘基Ile224和Ser233形成氫鍵，與Glu212、Val220和Ile229也有反應(yīng)[31]。敵草隆（diuron，DCUM）的芳香取代基與 Phe255形成氫鍵，提高了其抑制活性[32]。TeA是一種從鏈格孢菌里分離提取出來的抑制PSII的除草化合物，其作用機制也是與靶蛋白D1的相互作用有關(guān)[33]。本研究采用分子對接的手段，發(fā)現(xiàn)羊脂酸與植物L(fēng)HC中氨基酸殘基Gly68、Phe67、Phe69和Arg197形成氫鍵和p-π鍵，其結(jié)合能量為-20.9 kJ·mol-1，兩者存在較強的作用力，羊脂酸具有開發(fā)成光合作用抑制劑類除草劑的潛力。

4 結(jié)論

CcLhca-J9是一個典型的捕光復(fù)合物I葉綠素a/b結(jié)合蛋白，與羊脂酸結(jié)合形成氫鍵和 p-π鍵，同時CcLhca-J9表達量在羊脂酸處理小飛蓬葉片后存在明顯的特異性。因而，推測CcLhca-J9在羊脂酸抑制小飛蓬葉片生長過程中起了較為關(guān)鍵的作用，但是該基因是否為植物源羊脂酸的靶標(biāo)基因有待更進一步的功能驗證。