油菜素內酯應用于甘蔗組織培養快繁的研究

張婭 顧明華 朱可針 梁瓊月 龔銀花 何冰 何麗珊

摘 ?要：為了研究油菜素內酯（brassinolide， BL）對甘蔗組織培養的影響，本研究以“植物器官從頭再生”“體細胞胚再生”2種組培快繁體系為基礎，通過添加適宜濃度的2，4-表油菜素內酯（2，4-epibrassinolide， 2，4-EBL）于基礎培養基中，設計了6套適用于甘蔗快繁的組合培養基方案。并于不同誘導階段（不定根誘導、愈傷組織誘導、成苗誘導）對接種材料的形態特征及內源植物激素（油菜素內酯、玉米素核苷、生長素、脫落酸）的含量變化進行了統計與測定，探討了油菜素內酯應用于甘蔗組織培養快繁技術的可行性。結果表明，將不定根培養基MS + 0.2 mg/L 2，4-D + 0.2 mg/L LFS與成苗培養基MS + 0.5 mg/L KT +（0.2 mg/L IBA / 0.2 mg/L 2，4-EBL）+ 300 mg/L Pro進行組合，為甘蔗組培快繁的較優方案，油菜素內酯可應用于甘蔗組織培養快繁技術，且體細胞胚再生成苗優于愈傷組織再生成苗，成苗時間可縮短至32 d。

關鍵詞：甘蔗;組織培養;油菜素內酯;植物激素

中圖分類號：S566.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Based on two tissue culture and rapid propagation systems of “plant organ de novo regeneration” and “so-matic embryo regeneration”， six combinations of medium were designed by adding appropriate concentration of 2，4-epibrassinolide into the basic medium to explore the effects of brassinolide （BL） on sugarcane tissue culture. The morphological characteristics of different induction stages， including adventitious root induction， callus induction and seedling induction， were analyzed. The content changes of endogenous plant hormones （brassinolide， zeatin riboside， indole 3 acetic acid， abscisic acid） were determined. The feasibility of brassinolide application in sugarcane tissue cul-ture and rapid propagation was discussed. The combination of adventitious root medium MS+0.2 mg/L 2.4-D+0.2 mg/L LFS and seedling medium MS + 0.5 mg/L KT+（0.2 mg/L IBA / 0.2 mg/L 2，4-EBL）+ 300 mg/L Pro was the better scheme for sugarcane tissue culture and rapid propagation. Brassinolide could be used in tissue culture and rapid propagation of sugarcane. The regeneration time of somatic embryo was better than that of callus， which could be shortened to 32 days.

Keywords： sugarcane; tissue culture; brassinolide; phytohormone

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.014

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是我國重要的糖料作物，產糖量占我國食糖總產量的90%以上[1]，同時，甘蔗作為C4高光效及同源多倍體遺傳研究的模式植物，具有重大的科研價值[2]。受限于遺傳背景復雜且全基因組測序未完成的阻礙，甘蔗的育種進程緩慢[3]。現今的甘蔗傳種方式以農民自留種為主，且多為第三年蔗，因其易攜帶宿根矮化病、黑穗病、花葉病及黃葉病等病害，導致種苗的質量差，常對后續甘蔗的生產造成嚴重影響[4]。基于甘蔗幼嫩組織的全能性，利用莖尖生產脫毒苗不失為最有效的繁種方式[5-6]。大田研究數據表明，應用甘蔗脫毒健康種苗可使甘蔗增產15.1%～52.0%，蔗糖糖分提高0.12%～ 1.71%[4]。

油菜素甾醇（brassinosteroids， BRs）是一類在植物中廣泛存在、含多羥基的甾醇類化合物的統稱，油菜素內酯（brassinolide， BL）是植物體內BRs中生物活性最強的一種[7]。近些年，伴隨有關BRs合成途徑、信號通路及其與其他激素互作調控機制的研究取得顯著進展[8-10]，使得BL及其類似物在組培快繁領域的應用成果也快速積累。于中草藥（甘肅貝母）[11]、林木（桉樹、胡楊）[12-13]、蔬菜（馬鈴薯）[14]及水果（香蕉、五指毛桃）[15-16]等材料的再生培養試驗中均發現，BL及其類似物對不定根誘導和再生培養體系構建的促進效果明顯，且當BL的應用劑量小于1 mg/L時效果更佳。有關BL在甘蔗組培中的應用研究，Chavan等[17]將2～7 mg/L濃度梯度的BL添加于培養基中，以探究其對甘蔗Co.86032莖尖繁殖效率的影響。該研究發現：在添加5 mg/L BL培養基上生長的材料獲得比對照更強的生命力及更高的成活率。但遺憾的是該研究并未對BL與其他激素的互作關系進行探討。

目前將BL及其類似物應用于甘蔗組培快繁的研究較少，基于BL具有低量高效的促生長特性，本研究以植物器官從頭再生、體細胞胚再生2種組培快繁體系[18]為基礎，通過添加適宜濃度的BL于MS培養基中，共設計6套適用于甘蔗快繁的培養基組合方案，旨在為BL應用于甘蔗組培快繁技術提供一定理論研究基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

實驗材料：‘德蔗03-83’，采自廣西大學農學院試驗田。試驗相關激素：靈發素（lingfasu， LFS， PGR-08， 99%）、2，4-表油菜素內酯（2，4-epibras?si?n?o-lide， 2，4-EBL， 99%）、萘乙酸（naphthaleneacetic acid， NAA， 99%）、激動素（kinetin， KT， 99%）、吲哚丁酸（indole butyric acid， IBA， 99%）、脯氨酸（proline， Pro， 99%），上述試劑均購于南寧市科杰生物試劑經營部。激素含量測定試劑盒：油菜素內酯（brassinolide， BL）、玉米素核苷（zeatin riboside， ZR）、生長素（indole 3 acetic acid， IAA）、脫落酸（abscisic acid， ABA）酶聯免疫檢測試劑盒均購自北京北農天一生物技術有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?外植體的獲取及不定根的誘導 ?于連續晴朗的艷陽天上午9：00?10：00，砍下健壯成熟的甘蔗莖尖。剝離大部分外層組織后，在超凈工作臺中繼續剝離剩余外層組織直至獲得最幼嫩莖尖。將莖尖置于無菌鋁盤上，并用無菌刀截去頭尾后切成1～2 cm的小段，隨后接入不定根誘導培養基中（表1），每瓶接種4個外植體，以每10瓶為1個重復，設3個重復共計接種30瓶。材料置于恒溫培養室（26±2）℃內避光培養11 d后，將光照時間重新設定為12 h光/12 h暗，光照強度設為1000 lx。觀察統計外植體存活率及不定根發生率[19]。

1.2.2 ?愈傷組織的誘導 ?待不定根誘導完成后，將不定根從外植體上切下，分別轉接至方案O1/O2及方案O3/O4對應的愈傷組織誘導培養基中（表1），每瓶接種3條不定根，以每5瓶為1個重復，每處理共接種15瓶。置于（26±2）℃恒溫培養室中培養，光照時間設定為12 h光/12 h暗，光照強度為1000 lx，每2周繼代1次，定期統計愈傷組織發生率[19]。

1.2.3 ?成苗誘導 ?比較“植物器官從頭再生”“體細胞胚再生”2種組培快繁體系的成苗效率，即分別將經方案O1、O2、O3、O4誘導生成的愈傷組織（1～2 cm的小團塊）轉接至各方案對應的成苗培養基，或直接將方案S1、S2誘導的不定根分別轉接到各方案對應的成苗培養基中（表1）。每瓶接種4團愈傷組織或4條不定根，以每3瓶為1個重復，每處理共接種9瓶。所有材料均置于（26±2）℃恒溫培養室中培養，光照時間為12 h光/12 h暗，光照強度為1000 lx，統計各方案的成苗率[19]。

1.2.4 ?甘蔗無菌苗的激素測定 ?分別采集6套培養方案所培育的生根苗鮮樣0.5 g，每個處理重復3次，共計12個樣品（方案O1、O2處理均無成苗），迅速浸過液氮后置于?80 ℃冰箱中保存，參照間接競爭酶聯免疫吸附分析法（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay， ic-ELISA）[20]測定樣品中植物內源激素BL、ZR、IAA與ABA的含量。

1.3 ?數據處理

采用2019版Excel軟件整理數據，SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（anova），Origin 2019軟件作圖。

2 ?結果與分析

2.1 ?不定根誘導情況（初代培養）

接種甘蔗莖尖于不定根誘導培養基MS+ 0.2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L LFS上，7 d左右外植體膨大，由白色轉為微淺褐色（圖1A），11 d后結束暗室培養，膨大組織上長出嫩白短須的根狀物，即為不定根（圖1B），待不定根長約3～5 cm時可轉入下一階段進行愈傷組織誘導。除個別外植體發生污染及褐化壞死外，在結束初代培養時，外植體存活率為99%，不定根發生率為77%（圖2A）。

2.2 ?愈傷組織誘導情況

將初代培養階段誘導的不定根切下，分別接種到方案O1/O2（MS+0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA），方案O3/O4（MS+0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L 2，4-EBL）的2種愈傷組織誘導培養基中。培養的第19 天，2種培養基中均觀察到不定根誘導出了愈傷組織（圖1C）。接種20 d后，添加激素2，4-EBL的培養基其愈傷組織誘導發生率達到最大，發生率為17%;接種37 d后，添加激素NAA的培養基其愈傷組織誘導發生率達到最大，發生率為39%（圖2B）。

2.3 ?成苗誘導情況

將方案O1、O2、O3、O4中由不定根誘導產生的愈傷組織，及方案S1、S2初代培養誘導產生的不定根分別接種于各方案所對應的成苗培養基中。培養21 d后，觀察6種培養基組合方案的成苗誘導情況。

方案O1、O2誘導產生的愈傷組織接種于成苗培養基后不能誘導成苗，方案O3、O4誘導產生的愈傷組織均能誘導成苗，其生長表現為：苗株單叢、莖部纖弱嫩白、無葉展開（圖1D）。方案O3成苗培養基（含0.2 mg/L IBA）的誘導出苗率為58.3%，方案O4成苗培養基（含0.2 mg/L 2，4-EBL）的誘導出苗率為24.7%，方案O3較O4的誘導成苗率增加了33.6%（表2）。

方案S1、S2初代培養階段誘導的不定根分別接種于成苗培養基后皆能誘導成苗（圖1E，圖1F），方案S1成苗培養基（含0.2 mg/L IBA）誘導的苗株其莖部粗壯濃綠、葉展開，苗株單叢;方案S2成苗培養基（含0.2 mg/L 2，4-EBL）誘導的苗株其莖部纖細淡綠、葉呈蜷曲狀;培養的第7天，方案S1、S2相應的出苗率分別為97.3%、87%，S1誘導出苗率較S2增加10.3%。培養的第14天，方案S1、S2的出苗率均可達100%（表2）。

可見，方案S1、S2（甘蔗體細胞胚再生成苗體系）的成苗率優于方案O3、O4（器官從頭再生成苗體系）（表2）。同為添加0.2 mg/L IBA的成苗培養基處理，方案S1的誘導成苗率較方案O3提高41.7%，同為添加0.2 mg/L 2，4-EBL成苗培養基處理，方案S2較方案O4的誘導成苗率提高75.2%。

2.4 ?誘導苗株的內源BL、ZR、IAA與ABA含量分析

分別測定方案O3、O4（經愈傷組織誘導）、方案S1、S2（不定根直接誘導）苗株內源激素BL、ZR、IAA及ABA的含量變化。在外源IBA或2，4-EBL的處理下，激素BL的含量在2種再生成苗體系中的表現基本相同（圖3A）。而經愈傷組織誘導成苗時，與0.2 mg/L IBA處理相比，添加0.2 mg/L 2，4-EBL可將內源ZR、IAA與ABA的含量水平分別降低65.2%、42.8%、83.1%。通過不定根直接誘導成苗時，與0.2 mg/L IBA處理相比，添加0.2 mg/L 2，4-EBL可將內源ZR的含量水平顯著降低63.2%;但IAA、ABA含量水平顯著上升，分別提高97.2%、88.2%（圖3B、圖3C、圖3D）。

3 ?討論

通過將6套組合培養基方案對甘蔗莖尖的快繁效果進行比較，體細胞胚再生成苗快繁體系（方案S1、S2）優于器官再生成苗快繁體系（方案O3、O4），而方案S的IBA處理又優于2，4-EBL處理，即快繁方案的比較結果應為：S1> S2> O3 > O4。

植物的離體器官再生，是IAA以類似于側根發生的方式，即通過誘導中柱鞘類細胞分化產生愈傷組織[21-23]。側根發生時，高濃度的BL可激活IAA阻遏基因表達從而負調控IAA信號，抑制側根發生;低濃度的BL則調控IAA的運輸與再分配，促進側根形成[24]。由此猜測，2，4-EBL對不定根所起的作用，可能是以類似方式對IAA實現負調控，進而影響愈傷組織的發生及分化。在本研究的愈傷組織誘導階段，考慮到材料對所添加的0.5 mg/L 2，4-EBL并未完全代謝，導致轉接至方案O4所對應的成苗培養基（添加0.2 mg/L 2，4-EBL）后，造成材料中2，4-EBL的作用效應高度累積，抑制了IAA的分泌，致使愈傷組織不能正常分化，方案O4的成苗效率弱于方案O3（添加0.2 mg/L IBA）。

體細胞胚的再生過程受到IAA、ZR及ABA等3種植物激素的協同調控。其中，IAA以其在愈傷組織中的濃度梯度為信號，誘導并維持莖端分生組織干細胞的產生[18];ZR作為細胞分裂素的主要活性成分，其響應因子能直接激活干細胞維持基因的表達，從而調控莖尖干細胞的活性[25]。IAA與ZR對分生組織的產生及活性起著直接作用。而ABA則通過負反饋調節于IAA，從而實現對體細胞胚發生的調控[26]。本研究中，方案S2通過低量0.2 mg/L 2，4-EBL的添加，IAA的含量水平大幅升高，雖生根苗的ZR含量稍有下降，ABA水平上升，但并未影響分生組織干細胞的正常產生，苗株得以生長;方案S1通過添加0.2 mg/L IBA，生根苗內源IAA、ABA含量水平下降，雖分生組織干細胞發生受阻，但ZR含量升高，仍能激活干細胞維持基因的表達，細胞得以分裂，苗株實現正常生長。

4 ?結論

通過篩選比較6套甘蔗快繁成苗方案，證明油菜素內酯可應用于甘蔗組織培養快繁過程，且選擇體細胞胚再生成苗培養體系優于愈傷組織再生成苗培養體系，即通過甘蔗莖尖誘導不定根，再由不定根直接誘導成苗，經32 d連續培養可得到甘蔗無菌苗植株。同時，較優的培養基組合方案為，不定根培養基：MS+0.2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 08，成苗培養基：MS+0.5 mg/L KT+0.2 mg/L IBA（0.2 mg/L 2，4-EBL）+300 mg/L Pro。

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責任編輯：沈德發