臨潁縣辣椒大田病害調(diào)查及主要病害的病原鑒定

李小杰 邵欣欣 白靜科 李勝利 劉暢 李淑君 郭艷春

摘? ? 要：針對近年來臨潁縣辣椒病害日益嚴(yán)重、防治困難等問題，為明確病害發(fā)生種類，2020年6—9月對臨潁縣辣椒病害進(jìn)行調(diào)查，采集具有典型癥狀的病害樣品進(jìn)行病原鑒定。調(diào)查結(jié)果表明，臨潁縣辣椒病害有病毒病、根腐病、疫病、立枯病、根結(jié)線蟲病、早疫病、炭疽病和黑斑病等8種，其中，根莖部病害以根腐病為主，葉部病害以病毒病和早疫病為主，果實病害以炭疽病為主。對主要病害進(jìn)行病原鑒定和致病性測定，將辣椒根腐病的病原鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），病毒病的毒原有煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV ）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY），早疫病的病原為鏈格孢菌（Alternaria alternata）。炭疽病的病原為喀斯特炭疽菌（Colletotrichum karstii），是引起辣椒炭疽病的初次報道。試驗結(jié)果為辣椒病害的準(zhǔn)確識別和精準(zhǔn)防控提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：辣椒;臨潁縣;病害調(diào)查;病原;致病性

中圖分類號：S641.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）12-010-06

Abstract： In view of the increasingly serious pepper diseases and difficult control in Linying county in recent years， the diseases of pepper in Linying county were investigated from June to September 2020， and the disease samples with typical symptoms were collected for pathogen identification. The results of the survey showed that there were 8 kinds of pepper diseases including viral diseases， Phytophthora blight， root rot， root-knot nematode， damping off ， early blight， anthracnose and black spot. Among them， root rot was the main disease in rhizome， viral diseases and early blight were the main diseases in leaf， and anthracnose was the main disease in fruit. The pathogen of pepper root rot was identified as Fusarium oxysporum. Viral diseases include Tobacco mosaic virus， Cucumber mosaic virus and Potato virus Y. The pathogen of early blight was identified as Alternaria alternata. It was the first report that pepper anthracnose was caused by Colletotrichum Karstii. This study provides theoretical basis for the identification and prevention of pepper diseases.

Key words： Pepper; Linying county; Disease investigation; Pathogen; Pathogenicity

辣椒（Capsicum annuum）屬茄科一年生草本植物，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值。近年來，隨著辣椒種植結(jié)構(gòu)的不斷變化以及受連作障礙和氣候條件等的影響，辣椒病害日趨嚴(yán)重且呈現(xiàn)復(fù)雜化[1-2]。目前，已報道的辣椒病害有10余種，其中苗期病害主要有病毒病、猝倒病、立枯病、灰霉病等，成株期病害主要有青枯病、疫病、枯萎病、炭疽病等[3-6]，嚴(yán)重影響辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)。辣椒疫病、枯萎病和炭疽病是辣椒生產(chǎn)中發(fā)生普遍且危害較為嚴(yán)重的幾種病害，常造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[7-9]。

引起辣椒病害的病因、病原不同，防治方法也有所不同。同時，因為有些病害癥狀非常相似，很難用肉眼區(qū)分，給病害的精準(zhǔn)防控帶來巨大困難。因此，準(zhǔn)確識別田間病害種類，對病害的防控十分重要。河南省是我國朝天椒（俗稱小辣椒）種植面積最大的省份，臨潁縣又是全省重要的朝天椒基地，種植面積2.0萬hm2以上，年產(chǎn)干辣椒10萬t以上，是當(dāng)?shù)氐闹饕?jīng)濟(jì)作物和重要經(jīng)濟(jì)來源[10]。但隨著連作和種植年限的增加，辣椒病害日趨嚴(yán)重，尤其是盛花期及果實生長期遇到高溫多雨天氣，易造成病害發(fā)生與傳播，導(dǎo)致大面積落花落果，已成為制約朝天椒產(chǎn)量和品質(zhì)提高的主要因素。筆者于2020年6—9月對臨潁縣朝天椒生產(chǎn)基地進(jìn)行了病害調(diào)查，采集典型癥狀病害樣本進(jìn)行病原鑒定，以期為臨潁縣及河南辣椒病害防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查及樣本采集

2020年6—9月，分別于苗期、開花結(jié)果期對臨潁縣辣椒生產(chǎn)基地的辣椒病害進(jìn)行調(diào)查，采集具有典型癥狀的病害樣本117份。其中，疑似病毒病樣本37份、根莖部樣本55份、葉部樣本9份、果實樣本16份（表1），分別裝于牛皮紙袋中，放入裝有冰袋的低溫保藏箱中立即帶回實驗室進(jìn)行病原分離鑒定。

1.2 病原真菌的分離純化

采用組織分離法，切取病健交界處病組織，置于PDA培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。待菌絲長出后，挑取目的菌絲放入新的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即得純化菌株。觀察分離菌株的形態(tài)特征、菌絲及孢子形態(tài)。

1.3 病原真菌的分子鑒定

參照真菌基因組DNA柱式提取試劑盒說明書，提取分離菌株基因組DNA作為模板，應(yīng)用真菌鑒定通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、β-微管蛋白基因引物TUB2-F（AACATGCGTGAGATTGTAAGT）和TUB2-R（ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：DNA模板1 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，2×PCR Taq MasterMix 12.5 μL，雙蒸水補(bǔ)足到25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，將膠回收后委托生工生物有限公司進(jìn)行測序。將獲得的各基因序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對分析，選擇同源性較高的序列用MEGA 7軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 病毒種類的分子鑒定

利用Trizol（Thermo Fisher Scientific）法提取不同辣椒病毒病樣本總RNA，具體方法參照說明書。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa）說明書，將病毒RNA合成雙鏈cDNA作為模板，利用TMV、CMV、PVY和TEV特異性引物[11]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系同1.3。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性40 s，51 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共30個循環(huán);72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，將膠回收后委托生工生物有限公司進(jìn)行測序，并將序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對分析。

1.5 病原真菌的致病力測定

含菌麥粒接種法：將小麥清洗干凈煮至喝飽水未開花狀態(tài)，控水后稱取200 g裝入18×36×5絲規(guī)格的透明食用菌栽培袋中，用配套的套環(huán)封口，置于培養(yǎng)箱中28 ℃，70%濕度避光培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)過程中每隔1 d搖晃食用菌栽培袋換氣。將直徑8.5 cm、高7 cm小花盆里裝入一半花盆的基質(zhì)，每花盆放入10 g培養(yǎng)好的含菌種麥粒，再補(bǔ)放基質(zhì)至花盆滿，移入辣椒苗，日常管理。10 d后觀察發(fā)病情況。

刺傷接種法：選擇健康的辣椒果實，用滅菌的針頭刺傷其表面，然后切取1 cm×1 cm的真菌菌絲塊貼于刺傷的果實表面，用脫脂棉蘸取無菌水保濕24 h，7 d后觀察發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨潁縣辣椒病害發(fā)生概況

通過對臨潁縣4個主要辣椒種植區(qū)的病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，臨潁縣辣椒病害有病毒病、根腐病、疫病、立枯病、根結(jié)線蟲病、早疫病、炭疽病和黑斑病等8種（表2）。其中，辣椒病毒病發(fā)生較普遍，從苗期到成熟期均可發(fā)病，在生長前期危害嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為植株矮化，葉片花葉、黃化、畸形等癥狀;辣椒根莖類病害主要有根腐病、疫病、立枯病和根結(jié)線蟲病，其中，以根腐病發(fā)生較為嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為植株矮小，葉片黃化萎蔫，根部變褐;辣椒葉果類病害主要是早疫病和炭疽病，在辣椒生長的各個時期均有發(fā)生，其中，以果實炭疽病發(fā)生較為普遍且危害嚴(yán)重。辣椒黑斑病零星發(fā)生，且多發(fā)生在日灼處。

2.2 辣椒主要病害的田間癥狀及病原鑒定

2.2.1 辣椒病毒病 辣椒病毒病的田間癥狀表現(xiàn)主要有花葉型：典型癥狀主要表現(xiàn)為病葉、病果出現(xiàn)不規(guī)則褪綠，呈現(xiàn)黃綠相間的斑駁，輕癥植株生長正常，嚴(yán)重時植株生長緩慢或矮化（圖1-a）;畸形：主要表現(xiàn)為葉面皺縮，葉緣向上卷曲，嚴(yán)重時葉片變成線狀，后期植株上部節(jié)間短縮，呈叢簇狀（圖1-b）。對采集的37個疑似病毒病樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，28份樣本中同時擴(kuò)增出TMV和CMV兩種病毒的特異條帶，6份樣本中同時擴(kuò)增出TMV、CMV和PVY三種病毒的特異條帶（圖1-c），1份樣本中只檢測到TMV的特異條帶，2份樣本中只檢測到CMV的特異條帶，各樣本均未擴(kuò)增出TEV病毒的特異條帶。由此表明，臨潁縣辣椒病毒病的毒原主要有煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）和馬鈴薯Y病毒（PVY），且復(fù)合侵染率達(dá)到90%以上。

2.2.2 辣椒根腐病 辣椒根腐病的田間發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為病株地上部枝葉變黃萎蔫，拔出后發(fā)現(xiàn)根系變褐腐爛（圖2-a），表皮易脫落。其中，樣本編號為LJ-53的分離菌株在PDA培養(yǎng)基上，菌落為白色，菌絲茂密，呈疏松棉絮狀（圖2-b）。大型分生孢子鐮刀形，無色，具3～5個隔膜;小型分生孢子卵形至腎形，單胞或雙胞，無色（圖2-c）。利用含菌麥粒接種法對菌株LJ-53進(jìn)行回接，發(fā)病癥狀與田間癥狀相似（圖2-d）。

分子鑒定結(jié)果表明，LJ-53分離菌株與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）序列最大相似率為99.85%，且與Fusarium oxysporum Fo5176位于同一進(jìn)化分支（圖3）。

2.2.3 辣椒早疫病 辣椒早疫病的發(fā)病葉片上病斑呈圓形，黑褐色，有同心輪紋，潮濕時有黑色霉層（圖4-a）。其中，從樣本編號為LJ-60的病葉上分離的菌株在PDA培養(yǎng)基上，菌落呈圓形絨毛狀，正面為灰色或灰黑色，背面為黑色（圖4-b～c）。菌絲具隔，暗黑色，分生孢子磚隔或多隔，錐形（圖4-d～f）。依據(jù)菌落和分生孢子特征，初步鑒定為鏈格孢菌（Alternaria）。

分子鑒定結(jié)果表明（圖5），LJ-60分離菌株與鏈格孢菌（Alternaria alternata）序列最大相似率達(dá)99.92%，且與Alternaria alternata G408位于同一進(jìn)化分支。

2.2.4 辣椒炭疽病 辣椒炭疽病可危害葉片、莖和果實。生長后期主要危害果實，且以成熟果受害較重。發(fā)病果實上呈圓形或不規(guī)則形病斑、稍凹陷，斑上生黑色小點(diǎn)，干燥時病斑常干縮似羊皮紙（圖6-a）。其中，從樣本編號為LJ-65的病果上分離的菌株在PDA培養(yǎng)基上，菌絲生長密實，正面初呈白色或黃色，有稍隆起的同心輪紋，上面著生小黑點(diǎn)，后期溢出淡紅色黏狀物（圖6-b～c）。分生孢子盤無剛毛，分生孢子長橢圓形，無色，單胞（圖6-d～f）。分子鑒定結(jié)果表明，LJ-65分離菌株與喀斯特炭疽菌（Colletotrichum karstii）的同源性高達(dá)99.17%，且位于同一進(jìn)化分支（圖7～8）。利用刺傷接種法對LJ-65菌株進(jìn)行回接驗證，辣椒果實接種部位出現(xiàn)圓形凹陷病斑（圖6-g），表明該菌株具有致病性，為辣椒炭疽病的病原。

3 討論與結(jié)論

本研究調(diào)查結(jié)果表明，臨潁縣辣椒病害主要有病毒病、早疫病、根腐病、炭疽病、疫病及根結(jié)線蟲病等。其中，病毒病在辣椒生長前期危害較重，且毒原種類復(fù)雜，復(fù)合侵染率較高，這與前人研究結(jié)果基本一致[12]，但本試驗中只用了TMV、CMV、PVY和TEV四種病毒的特異引物進(jìn)行了毒原種類檢測，后期將增加分子檢測的病毒種類。辣椒根腐病為辣椒常見的土傳病害，在全國各地普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)。引起辣椒根腐病的病原菌有尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、腐皮或茄病鐮孢菌（Fusarium solani）、木賊鐮孢菌（Fusarium equiseti）和串珠鐮孢菌（Fusarium moniliforme）等，其中，以腐皮或茄病鐮孢菌（Fusarium solani）為主[13-14]。筆者從臨潁縣發(fā)病辣椒根部分離出大量鐮刀菌，且多數(shù)菌株具有較強(qiáng)的致病性，經(jīng)鑒定均為尖孢鐮刀菌，與前人報道有所不同，這可能與地域或品種差異有關(guān)。

目前，已報道的辣椒炭疽病的病原菌有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporoides）、黑色炭疽菌（Colletotrichum nigrum）、黑點(diǎn)炭疽菌（Colletotrichum capsici）、尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）和喀斯特炭疽菌（Colletotrichum karstii）等15種左右，其中，以膠孢炭疽菌（C. gloeosporoides）和黑點(diǎn)炭疽菌（C. capsici）侵染較為普遍[15-17]。目前，國內(nèi)外對其他植物炭疽病的病原菌C. karstii已有相關(guān)研究報道[18-20]，但未見在辣椒上的相關(guān)報道。筆者從臨潁縣發(fā)病辣椒果實上分離出的炭疽菌經(jīng)鑒定為喀斯特炭疽菌（C. karstii），這是引起辣椒炭疽病的初次報道，是否還有其他炭疽菌種類，還需擴(kuò)大取樣范圍和數(shù)量，進(jìn)一步明確辣椒炭疽病的致病菌，并對其生物學(xué)特性及致病機(jī)制進(jìn)行初步研究，為辣椒炭疽病的準(zhǔn)確識別和防控提供理論依據(jù)。另外，在某些發(fā)病辣椒果實上能同時分離出炭疽菌和鏈格孢菌，且個別鏈格孢菌具有弱致病性，說明辣椒炭疽病和黑斑病可能混合發(fā)生，也有可能是炭疽菌侵染辣椒果實形成壞死病斑后造成鏈格孢菌腐生的結(jié)果。

筆者明確了臨潁縣辣椒病害主要有病毒病、根腐病、早疫病和炭疽病等，其中，病毒病的主要毒原有TMV、CMV和PVY，且復(fù)合侵染率較高;由尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）侵染引起的根腐病為辣椒的主要根莖部病害;由鏈格孢菌（A. alternata）引起的辣椒早疫病和炭疽菌（Colletotrichum sp.）引起的辣椒炭疽病是主要的葉果類病害，并初次報道了喀斯特炭疽菌（C. karstii）可引起辣椒炭疽病。本次試驗結(jié)果為臨潁縣辣椒病害的準(zhǔn)確識別提供了參考，對病害的精準(zhǔn)防控具有指導(dǎo)意義。

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