微環境酸堿度在組織工程骨再生中作用的研究進展

李佩儀 張新春

中山大學附屬口腔醫院 中山大學光華口腔醫學院 廣東省口腔醫學重點實驗室 廣州510055

頜骨是整個顏面部外形的支撐結構，也是咀 嚼器官、語言器官、呼吸器官的重要組成部分，繼發于外傷、腫瘤、炎癥等常見疾病的口腔頜面部骨缺損從生理、心理兩方面給患者造成嚴重影響。目前頜面骨再生仍以傳統的自體骨移植、同種異體骨移植、異種骨移植為主，這些方法具有供體受限、受體排斥、疾病傳播等弊端，社會醫療成本較高，尋找合適的頜面骨替代品一直是口腔骨修復研究的重要方向[1?2]。

組織工程骨因其來源廣泛、制作方便、無免疫原性等優點，已逐漸成為臨床骨缺損修復的研究熱點[3]。組織工程骨植入體內后，細胞及其代謝產物、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）、生長因子及機體對材料的反應產物構成了成骨微環境，是調動機體自身修復能力和生物材料再生功能的關鍵。成骨微環境的酸堿度參與免疫調控、血管再生和新骨形成，尤與骨骼系統直接相關，影響骨再生細胞功能及礦物鹽沉積，其水平與機體損傷和植入材料的降解產物有關，本文綜述成骨微環境酸堿度在組織工程骨再生中的研究進展，為頜面人工骨材料研發與轉化提供參考。

1 微環境酸堿度與組織工程骨再生

酸是細胞能量代謝的副產物，葡萄糖分子既可通過無氧代謝生成乳酸，也可通過有氧代謝轉化為乙酰輔酶A 和二氧化碳，二氧化碳在體液中形成的碳酸和碳酸氫鹽是機體pH 緩沖系統的重要組成部分[4]。健康的機體可通過呼吸、腎臟排泄和骨骼緩沖等過程，調節二氧化碳、碳酸氫鹽和H+間平衡以穩定pH[5]。腎病、呼吸系統疾病、糖尿病等疾病將導致系統性酸中毒或堿中毒，而腫瘤、創傷、感染和炎癥等病理狀態將干擾局部pH 緩沖系統，造成微環境酸堿失衡。骨組織羥磷灰石可根據體液酸堿度溶出或沉積以緩沖pH 變化[6?7]。此外，骨相關細胞對pH變化敏感，胞外H+在激活破骨細胞骨吸收的同時，抑制成骨細胞分泌骨基質、減少礦物鹽沉積[8?11]；堿性環境則刺激成骨細胞功能、抑制破骨活性，促進骨形成[12?13]。

頜面骨缺損由于血供減少、無氧代謝增加，血腫、感染、炎癥等反應聚積乳酸，形成局部酸性微環境。Hazehara?Kunitomo等[14]測量小鼠拔牙窩內pH，在最初2 d，pH 由7.4 降至6.8，7 d 后恢復至7.0左右。而組織工程骨因血管長入受限、炎癥反應及人工骨內細胞所處空間有限等因素，周圍體液緩沖效果較弱，易積聚酸性代謝產物，使細胞對pH 變化的敏感性上升[13,15]。微環境pH 是組織工程骨再生中重要的物理因素，影響人工骨表面蛋白吸附、成骨相關細胞遷移、黏附、增殖、分化、骨基質分泌成熟、生物礦化，以及骨缺損區炎癥反應和血管重建等骨再生過程，了解微環境pH 在組織工程骨再生中的作用可為頜面骨材料研發和臨床骨修復治療提供參考[9?11,16]。

1.1 組織工程骨表面蛋白吸附

來源于血液、細胞外液的蛋白吸附至植入材料表面是組織工程骨再生的第一階段，直接影響材料的細胞相容性[17]。骨植入材料表面蛋白可與胞膜整合素結合，為細胞黏附提供識別位點；同時控制晶體成核和生長，是生物礦化的關鍵[18?19]。

蛋白質在材料表面的吸附涉及范德華力，疏水作用力、靜電力及氫鍵作用，影響因素包括蛋白種類、構象、材料表面化學、粗糙度、溶液pH值等，而溶液pH 值是改變蛋白電負性和構象的關鍵因素[17?18]。蛋白質是具有酸性和堿性官能團的生物兩親性分子，總電荷與外界pH 值和蛋白等電點（isoelectric point，pI）有關。Yadav 等[20]調節溶液pH 使溶菌酶帶正電荷，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）帶負電荷，帶正電的溶菌酶可強力吸附于二氧化硅納米粒子的負電表面，吸附量隨溶菌酶濃度上升而上升，吸附最大值隨溶液pH接近溶菌酶等電點（pI為11.1[21]）而增加。相反，帶負電的BSA 無吸附現象。除蛋白?材料間的靜電作用力以外，pH 還通過改變蛋白構象影響二者間相互作用，這種構象轉變可能與蛋白內部電荷分布不均有關[22]。Kumar等[23]觀察二氧化硅納米粒子和溶菌酶的吸附行為，隨溶液pH 下降（pH 9.0/7.0/5.0），溶菌酶構象改變，納米顆粒表面蛋白吸附系數升高但蛋白吸附總量下降。Raoufi等[24]進一步利用熒光共振能量轉移方法，監測纖連蛋白在金納米顆粒上的構象變化，發現酸性pH 解折疊纖連蛋白，降低其親和力，減少吸附。

微環境酸堿度通過靜電作用力和蛋白構象初步篩選材料表面蛋白，細胞對不同蛋白、不同構象的黏附位點不盡相同，由此影響細胞黏附并改變整合素相關的信號轉導通路，影響骨再生[25]。

1.2 組織工程骨表面細胞遷移、黏附與增殖

骨修復相關細胞在人工骨材料表面的遷移、黏附與增殖是骨質形成和生物礦化的前期基礎，決定新骨形成和骨整合效果[26?27]。

胞外酸性微環境不利于間充質干細胞（mes?enchymal stem cells，MSCs）的遷移與黏附，但對破骨細胞的遷移黏附有促進作用。酸性預處理（pH6.8）的人骨髓間充質干細胞（human bone mar?row mesenchymal stem cells，hBMMSCs）遷 移 與黏附能力顯著下降[14]。但Ahn等[28]研究認為，胞外酸中毒可刺激破骨細胞合成含有精氨酸?甘氨酸?天冬氨酸序列的骨橋蛋白，激活Pyk2、Cbl?b、Src等相關信號通路，促進其遷移黏附。進一步研究在酸性環境下阻斷了巨噬細胞酸敏感離子通道1a（activated acid?sensing ion channel 1a，ASIC1a），發現巨噬細胞及其分化的破骨細胞遷移黏附能力下降，顯示酸性環境可能通過ASIC1a/整合素ανβ?3/Pyk2/Src 促進破骨細胞的遷移黏附[29]。破骨細胞遷移黏附能力的上升還可能與酸性微環境改變胞膜整合素蛋白構象有關[30]。整合素是胞膜上的異二聚體α/β跨膜蛋白，參與包括遷移和黏附在內的多種細胞活動。分子動力學模擬研究顯示，酸性pH使整合素構象由平衡態轉向高親和力的延伸?開放狀態，通過開放ανβ3 頭部進而活化黏附受體，上調細胞遷移黏附效率[31]。目前尚缺乏堿性環境對骨再生細胞遷移黏附影響的實驗報道，然而在大鼠皮膚全層創口的愈合研究中發現：堿性環境可降低人角質形成細胞和皮膚成纖維細胞的遷移活動，亦說明堿性pH 可能對骨缺損區細胞遷移有一定影響[32]。

微環境pH 影響MSCs 與成骨細胞的增殖能力。Hazehara?Kunitomo等[14]研究發現，酸性預處理（pH6.8）可增強hBMMSCs 表面干細胞標志物表達，提高細胞活力與增殖。Galow等[33]調節小鼠前成骨細胞培養pH 值，發現堿性環境（pH8.0～8.4）對其初期增殖也有顯著促進作用。然而Li等[34]在鈦表面制備分層微/納米孔膜，發現堿處理的鈦表面局部pH 升高，導致細胞發生堿中毒，顯著抑制了BMMSCs 增殖，提示堿性環境對細胞增殖有負面作用。將pH 范圍進一步拓寬后發現，酸性（pH6.3/6.7）與極堿（pH8.5）環境通過促進細胞衰老顯著抑制hBMMSCs 的增殖能力，而生理（pH7.0/7.4）與弱堿環境（pH8.0）更有利于細胞的生存與增殖[35]。

綜上，與過堿環境相比，生理性和弱堿性的微環境pH 對骨再生相關細胞的增殖有一定的促進作用，但酸性環境對細胞增殖的影響仍存在爭議。此外，目前關于微環境pH 對成骨相關細胞遷移、黏附的影響尚無定論，需更多研究以闡明其機制。

1.3 MSCs成骨向分化、骨基質分泌與生物礦化

MSCs遷移黏附至骨缺損區，在成骨相關轉錄因子作用下成骨分化，合成堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型膠原和非膠原蛋白，形成有機骨基質，基質沉積礦化為羥磷灰石形成新骨。有機骨基質在骨組織中占比約達30%，主要來源于成熟成骨細胞，其產量取決于干細胞成骨分化水平與成骨細胞的功能活性，二者均受胞外酸堿環境影響，而與生物礦化相關的骨礦物鹽沉積和破骨細胞功能也受微環境pH作用[36]。

胞外pH 影響干細胞成骨向分化與成骨細胞分泌骨基質蛋白。酸性微環境不僅抑制MSCs 成骨向分化，也降低成骨細胞的功能活性。酸性pH 可誘導MSCs 表達干細胞相關基因和蛋白，使其駐留在G0靜止期而不分化為終末細胞[37]。Tao等[38]研究發現，胞外H+可能通過GPR4/cAMP/PKA 通路抑制hBMMSCs 成骨分化。在骨基質合成方面，Fliefel等[35]認為酸性pH 降低hBMMSCs 膠原合成，抑制ECM 合成和ALP活性。體外實驗顯示，胞外pH 由7.5 降至6.6 時，hBMMSCs 的ALP 活 性和 膠原合成數量下降50%至70%[39]。此外，慢性酸中毒還通過下調小鼠成骨細胞基質Gla蛋白和骨橋蛋白基因表達，抑制骨基質合成[40]。與酸性環境不同，堿性環境可刺激MSCs 與成骨細胞的功能活性，利于細胞成骨向分化和基質合成。Kato等[41]發現，弱堿環境可提高成骨細胞的分化水平。Flie?fel等[35]認為，pH8.0 和8.5 是促進hBMMSCs 增殖和成骨向分化的適宜pH。此外，堿性環境還具有顯著的促骨基質合成效果。Bushinsky[42]調整小鼠顱骨培養環境模擬堿中毒狀態（pH＞7.5），堿性pH 在降低小鼠顱骨凈鈣流出量的同時，促進成骨細胞膠原合成。

微環境pH 除了影響細胞成骨向分化和骨基質合成，還在物理化學層面和細胞層面作用于骨基質礦化過程。Brandao?Burch等[9]研究發現，隨pH降低，胞外Ca2+濃度上升，羥磷灰石溶解，這與弱堿性羥磷灰石易溶于酸難溶于堿的特性有關；胞外H+還通過成骨細胞OGR1/Gq/11/磷脂酶C/蛋白激酶C 途徑促進環氧合酶?2（cyclooxygenase?2，COX?2）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）生成，小鼠前成骨細胞ALP 活性和鈣化結節數量隨pH 降低而顯著下降[43]。骨基質礦化除了與鈣鹽的物理化學沉積有關，還受破骨細胞骨吸收影響。破骨細胞活化后的骨吸收作用對骨生物礦化有負面效應，而胞外H+是破骨細胞成熟與活化的關鍵分子。Okito等[44]發現，酸性環境下小鼠成骨細胞G蛋白偶聯受體（G protein?coupled receptors，GP?CRs）質子傳感器GPR4 活化，激活cAMP/PKA 通路，使成骨細胞分化為破骨細胞支持表型，分泌更多核因子κB 受體活化因子配體（receptor acti?vator of nuclear factor?κB ligand，RANKL）。而胞外H+和RANKL 均可上調大鼠破骨細胞內破骨細胞轉錄因子和活化T 細胞核因子（nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1，NFATc1），繼而促進RANKL 刺激的NFATc1 核移位，誘導破骨細胞活化[45]。

與酸性環境不同，堿性pH 可促進胞外生物礦化并抑制破骨活化。調節小鼠前成骨細胞培養pH發現細胞外鈣沉積具有pH 依賴性，pH7.4 組直到第21天都無法檢測到鈣鹽沉積，而pH7.8組在21d后可見大量細胞外鈣[33]。堿處理的鈦植體表面在模擬體液中的表面礦化水平也有明顯提高[46]。類似的研究[35]發現，微環境pH 由7.4 上升至8.0 時，生物礦化程度輕微上升，8.0 時礦化成核中心穩定且不溶。但pH 進一步上升至8.5 后出現骨礦化不良，這可能與鈣鎂磷酸鹽在堿性環境下溶解有關。在骨吸收方面，堿性環境還可中和H+，干擾前破骨細胞融合形成多核破骨細胞的過程，降低破骨細胞β?葡萄糖醛酸酶釋放，抑制破骨活動，穩定骨礦物鹽[11,42]。

1.4 骨缺損區炎癥反應與血管再生

骨缺損區局部急性炎癥反應常由組織創傷或傷口感染引起，該炎癥反應常與破骨細胞激活的骨喪失有關，然而，成骨微環境的炎癥改變常常具有兩面性[47]。在大鼠牙槽骨缺損修復模型中，早期炎癥階段pH 較低，后期礦物沉積階段pH 回升，胞外pH 隨炎癥進程而變化[14]。此外，骨缺損早期由于缺氧導致細胞無氧酵解，產生酸性微環境。胞外酸性環境獨立于氧氣，對血管再生有不利影響。酸性pH 抑制大鼠成骨細胞血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達。短期內，骨缺損區血管斷裂引起的氧水平下降可上調VEGF，但持續的酸負荷下調VEGF表達，不利于血管再生[48]。

理想狀態下，骨修復早期的酸性炎性環境可募集骨祖細胞并維持其干性，后期的堿性抗炎微環境則有利于MSCs 的成骨分化、骨礦物鹽沉積及血管再生[45,49]。

2 調控成骨微環境酸堿度以促進骨再生修復

與酸性微環境促進骨質吸收相比，堿性微環境則通過刺激成骨細胞、抑制破骨細胞功能促進骨質形成[12?13]。堿化骨缺損區的酸性微環境是改善組織工程骨再生治療的可能方案。人工堿化骨再生微環境pH 的方法主要包括控制炎癥反應減少酸性物質生成、促血管生成改善細胞無氧酵解以及植入堿性材料中和酸性物質等。

2.1 抑制骨缺損區炎癥反應

骨創傷區因感染和組織損傷引起持續性炎癥反應，加劇酸化水平。控制感染和局部應用抗炎因子均可調節炎癥介質生成，緩解炎癥。Chen等[50]在大鼠牙槽骨炎性缺損中植入人顆粒蛋白前體（human progranulin，hPGRN）搭載的膠原蛋白膜支架，發現hPGRN 顯著抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF?α）表達并減少抗酒石 酸酸 性磷 酸酶（tartrate?resistant acid phospha?tase，TRAP）染色陽性的破骨細胞數量，說明hPGRN 可抑制缺損區炎癥反應和破骨細胞活化。然而炎癥反應復雜、炎癥介質多樣，對靶組織影響不可控，且炎癥反應與微環境pH 互為因果，試圖通過抗炎調節局部pH 存在一定困難，相關研究仍有待進一步加強[51]。

2.2 生物活性因子刺激血管重建

生物活性因子刺激血管重建是促進血管再生以克服缺氧酸性環境的主要方式。Du等[52]利用吸附VEGF 的納米羥磷灰石/珊瑚人工骨修復犬下頜骨缺損，發現VEGF 可促進骨愈合早期血管生成。Zhang等[53]使用明膠支架聯合編碼缺氧誘導因子?1α（hypoxia?inducible factor?1α，HIF?1α）的腺病毒修復大鼠牙槽骨缺損，發現過表達HIF?1α 可有效增強牙槽骨缺損中血管和新骨再生。然而，血管再生較為緩慢（每天100 μm～1 mm），受限于血管向組織工程骨內生長的固有障礙，通過恢復血流灌注以緩解低氧酸性微環境的進程過長，無法滿足組織修復的時間要求[15]。

2.3 堿性人工骨替代品中和成骨微環境酸性物質

利用堿性材料，創造利于細胞生存、成骨修復的弱堿環境，方法簡便，有一定的成骨效果，是組織工程學研究的新方向[33]。Shen等[54]制備的新型含鍶硅酸鈣（calcium silicate，CS）植骨材料表面形成的堿性環境（pH＞8）促進成骨細胞增殖并顯著提高ALP 活性。Liu等[11]在骨質疏松大鼠體內植入β?TCP、CS 以及摻入10%鍶的CS（Sr?CS）材料，與外周血不同，微環境pH 隨材料種類改變和時間推移而變化。在微環境pH 較高的組別內可觀察到更多新骨形成，破骨樣細胞延期響應及中間磷酸鹽層沉積，植入材料的堿性產物對骨質疏松性骨缺損有良好修復效果。類似的研究使用鎂黃長石修復骨質疏松大鼠骨缺損，與對照組相比，鎂黃長石植入后缺損區呈弱堿性并一直持續到第9周，期間可見成骨細胞活性增加，材料表面形成了與新骨結合的無機物中間層，提示其優異的骨再生性能[55]。Li等[56]通過水熱處理在純鈦表面制備一系列Mg?Fe 層狀雙氫氧化物（layered double hydroxide，LDH）薄膜。調節Mg/Fe 比例可控制Mg?Fe LDHs 層間距，賦予其可調節的OH-交換能力，形成pH 可控的局部微環境。體外實驗表明，Mg?Fe LDHs薄膜修飾的鈦表面具有良好的生物相容性和成骨活性，4∶1 的Mg?Fe 比例可為大鼠BMMSCs生長和成骨分化創造適宜的堿性微環境。

3 小結與展望

微環境酸堿度影響骨再生。向堿性方向改變骨缺損區病理酸性環境是可能的骨再生療法，堿性材料有望提高生物學性能，優化骨修復效果。然而，細胞感應胞外pH 變化并對其做出響應的機制尚未闡明，且酸堿度是非常復雜的病理生理因素，體內多種酸堿傳感器和運輸系統可在分子、細胞水平上嚴格穩定pH，揭示pH 相關信號傳導的特定作用也存在一定困難[57]。未來的研究需進一步分析微環境pH 影響骨再生的機制所在，為頜面組織工程骨研發提供更深入的參考依據。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。