脂聯素對骨髓間充質干細胞的作用及其調控機制

陳野 周豐 鄔瓊輝 車會凌 李佳璇 申佳琪 羅恩

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 四川大學華西口腔醫學院 成都610041

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchy?mal stem cells，BMSCs）是由中胚層發育而來的骨髓非造血干細胞。BMSCs 具有高度可塑性，可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞等，而其潛在的成骨分化能力是促進骨形成的基礎[1?3]。同時，BMSCs 具備強大的增殖能力、多向分化潛能、遷徙能力、低免疫原性、方便提取等優點，這也使其成為了促進骨修復重建的理想種子細胞[4]。但在目前實際應用的過程中發現BMSCs 在修復骨損傷時存在增殖、成骨分化以及遷徙能力不足等情況，這阻礙了其臨床應用，因此有大量研究尋求促進BMSCs 成骨作用的新方法和條件。近年來有研究發現，脂聯素（adiponectin，APN）對BMSCs 成骨作用具有正向調節作用，可能成為促進BMSCs 治療骨疾病的重要因子[5]。本綜述對APN 調控BMSCs增殖、成骨—成脂分化平衡、外周遷徙以及存活能力的具體機制的研究進展進行總結，并對其未來的研究方向進行展望，為臨床治療和預防骨折、骨缺損以及骨質疏松等顱頜面骨相關疾病提供理論依據。

1 脂聯素及其受體

APN 是一種主要由脂肪組織分泌的，具有調節代謝狀態和抗炎作用的蛋白質，其對代謝紊亂、心血管疾病、風濕性關節炎、癌癥以及骨相關病等多種疾病具有重要調節作用[6]。APN 是由244 個氨基酸所構成的相對分子質量約為3×104的蛋白質，APN 的C'末端的球狀結構域是其功能活性區[7]。在動物體內，APN 受體（adiponectin recep?tor，AdipoR） 分 為AdipoR1/R2 兩種類型。Adi?poR1 主要在骨骼肌中表達，而AdipoR2 在肝臟組織中表達最多，有研究證實，在骨組織內也有Ad?ipoR 的表達。AdipoR 在細胞內的結構域沒有激酶活性，APN 主要通過受體相互作用蛋白APPL1 介導相關信號通路的激活，如腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate?activated protein kinase，AMPK）通路和p38 絲裂原活化蛋白激酶（mito?gen?activated protein kinase，MAPK）通路等。APN作為脂肪因子不僅可以調節脂肪代謝，還能參與骨代謝，是連接脂肪組織與骨組織的重要紐帶[8]。APN 對骨組織及骨相關細胞具有復雜的作用，如APN 可以激活p38MAPK 以及c?Jun 氨基末端激酶通路促進成骨細胞增殖、分化以及礦化[9]；抑制破骨細胞的形成，促進破骨細胞凋亡等[10]。在BM?SCs 細胞膜上有AdipoR 的表達，APN 直接與BM?SCs 上的AdipoR 結合而激活一系列信號通路，影響BMSCs 增殖、分化、遷徙以及存活，調節BM?SCs的骨生成過程。

2 APN調節BMSCs的增殖能力

目前，APN 對BMSCs的增殖能力的調節作用存在爭議。Yu 等[11]研究發現，以1 μg·mL?1的APN處理從野生小鼠提取的BMSCs 會促進其增殖，但是隨著APN 的質量濃度增加，BMSCs增殖速度減小。而Pu 等[12]研究發現，外源性APN 對BMSCs的增殖能力影響不大。兩個實驗的結果都顯示在處理BMSCs 24 h 之后外源性APN 對BMSCs 的增殖能力的促進作用最強，而超過48 h 后其影響逐漸減弱。與之不同的是，Wang 等[13]發現，從敲除APN 基因（APN knockout，APN?KO）的小鼠骨髓中提取的BMSCs 比野生小鼠的BMSCs 增殖更快，其結果證實自身產生的APN會抑制BMSCs的增殖。在Kajimura 等[14]的研究中，APN?KO 小鼠在幼齡時表現為成骨增強，而老齡時由于交感神經緊張性增強，導致成骨減少。筆者推測APN?KO 小鼠的BMSCs 增殖加快的原因可能與FoxO1信號通路有關。總結多項實驗結果得知，APN 對BMSCs 的增殖能力的調節作用會因APN 的來源、質量濃度、作用時間以及動物模型而變化。

3 APN調節BMSCs成骨—成脂分化平衡

BMSCs 具有多向分化潛能，在一定條件下可以分化為成骨細胞，適應條件下也可以分化為脂肪細胞，而在機體內BMSCs 成骨分化和成脂分化相互制約，存在平衡關系[15]。BMSCs 的成骨成脂分化平衡分化受到轉錄因子、信號通路、微小RNA、組蛋白修飾酶等的多重調控[16]。研究表明，APN 可以通過多種途徑調節BMSCs的成骨成脂分化平衡，其主要作用是使BMSCs 趨向于成骨分化，從而使其成脂分化的比例減少。

3.1 APN可激活Wnt/β?catenin通路

Wnt/β?catenin 通路作為成骨的經典通路，同時也是APN促進BMSCs成骨分化的重要途徑。在Wnt/β?catenin 通路非激活狀態時，細胞質內的糖原合酶激酶（glycogen synthase kinase，GSK3β）使β?catenin 磷酸化，磷酸化的β?catenin 被泛素化降解以至于不能聚集到一定濃度而進入細胞核激活下游成骨相關轉錄因子。而當通路被激活時，GSK3β 會被抑制[17]，過量的β?catenin 進入細胞核內與T 細胞因子、淋巴增強因子結合，進而激活下游目的基因，促進BMSCs向成骨分化[18]。Wang等[19]發現，當用載有APN 基因的重組腺病毒轉染BMSCs 后，細胞中Wnt/β?catenin 通路相關的分子β?catenin、cyclinD1 表達增加；同時，成骨因子如骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）?2、Runt 相關轉錄因子（runt?related tran?scription factor，Runx）?2 和骨鈣蛋白（osteocal?cin，OCN）表達也增加，證實了APN 可以通過激活Wnt/β?catenin 通路促進BMSCs 成骨分化，加速顱骨缺損的修復。進一步研究可以發現，APN 與BMSCs 上 的AdipoR1 結合，從而抑 制GSK3β 激活，使β?catenin 在細胞質中聚集，促進BMSCs 成骨 分 化。這 證 明 了 通 過GSK3β/β?catenin 通 路，APN可以促進BMSCs成骨分化[20]。

3.2 APN可激活APN?APPL1?p38 MAPK通路

p38 MAPK 是MAPK 家族中主要的激酶，并且與BMSCs 成骨分化關系密切[21]。APN 與下頜骨BMSCs （jaw bone marrow BMSCs，JBMMSCs）的AdipoR結合可以使APPL1從細胞核轉移到細胞質中，并與AdipoR 結合，介導p38 MAPK 磷酸化激活[22]，p38 MAPK 激活使核轉錄因子c?Jun 磷酸化，并募集c?Jun 的共刺激因子p300，使環氧化酶?2 （cyclooxy?genase?2，COX?2） 基 因 表 達 增加，進一步使得前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）表達增加，PGE2可以使BMP?2表達增加，通過BMP?2/Smad/Runx?2 通路使成骨相關轉錄因子Runx?2 的表達增加，從而促進JBMMSCs 中的OCN、骨橋蛋白（osteopontin，OPG）等成骨因子的表達，進而促進JBMMSCs 分化為成骨細胞[23]。

3.3 APN 可激活磷脂酰肌醇?3?激酶（phosphati?dylinositol 3?kinase，PI3K）/蛋白激酶B（pro?tein kinase B，Akt）途徑

在PI3K/Akt 途徑中，PI3K 可催化磷脂酰肌醇?4,5?二 磷 酸（phosphatidylinositol?4,5?diphos?phate，PIP2） 生 成 磷 脂 酰 肌 醇?3,4,5?三 磷 酸（phosphatidylinositol?3, 4, 5?triphosphate， PIP3），

PIP3可以激活Akt，而激活的Akt 可以促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，促進成骨相關因子Runx?2、OCN、堿性磷酸酶的表達，促進BMSCs 成骨分化。Liu 等[24]證實了APN 可以與BMSCs 表面的AdipoR結合，通過APPL1介導激活PI3K/Akt通路激活PI3K，以及下游的Akt，進而促進BMSCs 成骨分化。

APN 還可以抑制第10 染色體同源丟失性磷酸酶?張力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）的表達從而間接激活PI3K/Akt 通路。PTEN 是一種腫瘤抑制基因，在PI3K/Akt 途徑中，PTEN 編碼的蛋白可以促進PIP3 生成PIP2，從而抑制BMSCs 成骨分化。APN 在激活PI3K 的同時，可抑制PTEN 基因的表達，從而促進BMSCs的成骨分化[24]。

3.4 APN可降低交感神經興奮性

骨髓交感神經興奮時，神經末梢會釋放去甲腎上腺素，作用于BMSCs 可引起賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶［lysine（K）?specific demethy?lase，KDM］4B、KDM6B表達減少。KDM4B和KDM6B具有使組蛋白中甲基化的賴氨酸殘基去甲基化，使組蛋白起到動態調節BMSCs 成骨因子的轉錄活動的作用，因此在交感神經興奮時BMSCs 成脂分化增強，而成骨分化減弱[25]。

Wu等[25]將APN灌注于APN?KO小鼠的側腦室中時，發現APN可以與下丘腦的AdipoR結合，由APPL1 介導了色氨酸羥化酶2（tryptophan hydrox?ylase 2，TPH2）激活以及五羥色胺受體2C表達增加，而TPH2可以通過促進大腦中五羥色胺的合成從而降低了交感神經的緊張性，增加BMSCs 中KDM4B 和KDM6B 的合成，使BMSCs 成骨分化增強，成脂分化減弱。這說明APN 可以通過作用于中樞神經系統，降低交感神經的興奮性，從而促進BMSCs成骨分化。

目前大部分實驗結果顯示，APN 可使BMSCs的成骨分化增加，成脂分化減少，但是有學者發現，骨髓脂肪組織旁分泌的APN或者BMSCs自分泌的APN 增多時成骨分化增強，然而體內實驗發現循環血中的APN 增多時機體的成骨作用受到抑制[19]。由于APN 的全身作用受到復雜的人體微環境的調控，其具體機制至今還不清楚。可能原因有以下4點：1）局部APN 過表達可能會以負反饋的形式引起循環血中APN 濃度降低，從而抑制遠處組織的成骨作用；2）APN可以通過增強胰島素的敏感性，通過AMPK 或者PPAR 配體介導脂肪動員和葡萄糖吸收增加，從而使脂肪組織減少，導致脂肪組織和胰島β 細胞分泌的成骨相關因子，如瘦素和胰島素減少，從而導致成骨作用減弱；3）瘦素和APN 都由脂肪組織分泌，相互具有拮抗關系，APN 分泌增多，會導致瘦素分泌減少，瘦素減少會導致BMSCs 成骨分化減少[26]；4）APN 會抑制成脂分化，導致脂肪細胞分泌的雌激素減少，從而抑制BMSCs成骨分化。

4 APN促進BMSCs向外周遷徙

BMSCs 是細胞療法和組織修復中最常用的干細胞，其強大的遷徙能力起到了重要作用。BMSCs 遷徙需要經過離巢、進入外周血循環和進入受損區域這3個階段[27]。在此過程中，復雜的化學分子機制和物理作用扮演著重要角色。APN 可以促進BMSCs 離巢并進入外周血，同時促進BMSCs 募集到骨缺損處或者骨折處，從而有利于BMSCs參與骨缺損或者骨折的修復。

基質細胞衍生因子?1（stromal cell?derived fac?tor?1，SDF?1）/趨化因子受體4［cysteine(C)?X?C motif chemokine receptor，CXCR4］軸是目前研究較多的趨化BMSCs 遷徙的通路，APN 對SDF?1/CXCR4 軸有調控作用。在糖尿病以及肥胖患者中，骨髓交感神經功能紊亂，使骨髓微環境中SDF?1濃度升高，血竇中SDF?1濃度降低，不利于表達CXCR4 的BMSCs 的趨化。Yu 等[28]發現，給食物源性肥胖小鼠皮下注射APN，骨髓中交感神經興奮性降低，導致骨髓組織中SDF?1 的水平下調，從而趨化BMSCs 進入外周循環。循環系統中的APN，可以與BMSCs 的AdipoR1 結合，使AipoR1?CK2?Smad1/5/8 復合體解離，從而使釋放的Smad1/5/8 被磷酸化，進入細胞核，上調SDF?1的轉錄，使骨缺損處形成高濃度水平的SDF?1，有利于BMSCs 向骨缺損處遷徙。Wu 等[29]進一步發現，APN 受體激動劑AdipoRon可以降低骨髓中SDF?1的濃度，有利于2型糖尿病相關的牙周炎所引起的牙槽骨吸收的恢復。

除了SDF?1/CXCR4 軸之外，Pu 等[12]發現APN可作用于JBMMSCs 的AdipoR，通過APPL1 介導AMPK 和p38 MAPK 的磷酸化激活，促進CXCL1和CXCL8 的表達，分別與CXCR1 和CXCR1/2 結合，從而使JBMMSCs 向外周表達CXCR1/2 的骨缺損處遷徙。APN 在促進JBMMSCs 向外周遷徙的同時，又可以通過APPL1?p38 MAPK 通路促進JBMMSCs 成骨分化，這兩個過程既同步又獨立，共同促進外周骨缺損處的愈合。

綜合實驗結果能夠得知，APN 對BMSCs從骨髓向外周遷徙具有確切的促進作用，而這主要是通過CXCL/CXCR軸來實現的。

5 APN有利于移植BMSCs存活

雖然BMSCs 可以遷徙到骨缺損處促進骨修復，但是BMSCs 從骨髓遷徙到骨損傷處的效率并不高[30]。目前研究者主要是通過組織工程技術將BMSCs 吸附到具有生物相容性的材料上植入骨缺損處來促進骨生成，但是仍存在植入體內的BMSCs 在缺血缺氧等環境內不易于存活、細胞凋亡等問題，因此除了種子細胞和生物材料之外常常還需要添加生長因子。研究[31?32]發現，APN可以通過AdipoR1 介導AMPK 通路激活，進而激活乙酰輔酶A，使凋亡相關基因Bax 表達減少，Bcl?2表達增多從而抑制BMSCs 凋亡。而生長因子如轉移生長因子β、堿性成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生長因子表達增多，利于BMSCs在缺氧缺血條件下生存。Malih等[33]研究發現，AdipoRon 可以作用于BMSCs，進而激活COX?2/PGE2/低氧誘導因子1（hypoxia inducible factor?1，HIF?1）通路，HIF?1 可以促進CXCR4、CC 趨化因子受體2、VEGF、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP） ?2、MMP?9 基因的表達。這證實了AdipoRon 可以激活COX?2/PGE2/ HIF?1 通路促進BMSCs 遷徙以及周圍血管生成從而提高其存活率。

綜合以上結果可知，APN 可通過抑制BMSCs凋亡，促進BMSCs 移動，以及分泌VEGF 等促血管生成因子，來有效增強植入BMSCs 的存活能力，有利于骨缺損的修復。

6 總結與展望

APN 對BMSCs增殖、分化、遷徙功能以及存活能力具有復雜的調節作用。APN 可以通過一系列化學信號通路以及降低交感神經緊張性促進BMSCs 成骨分化，通過CXCL/CXCR 軸促進BMSCs 向外周循環中遷徙，抑制細胞凋亡，促進其在缺氧缺血微環境中存活。

骨質疏松與BMSCs 成骨作用失調密切相關。研究發現，老年人以及糖尿病患者因為骨髓內氧化應激水平高，以及成脂因子表達增加，導致BMSCs 成骨分化減少，成脂分化增加，進而骨量—脂肪含量失衡，最終引起骨質疏松，而發生在頜骨則嚴重影響咀嚼功能以及種植體固位。APN可以下調骨髓氧化應激水平，調節BMSCs 成骨—成脂分化平衡并促進BMSCs 遷徙到遠處成骨。在口腔醫學領域，研究APN 在預防及治療骨質疏松相關頜骨骨折的作用以及促進種植體周圍骨整合的具體機制是未來研究的重要方向[34?38]。同時，APN 對BMSCs的這種復雜的調控作用，在頜面部外傷和良惡性腫瘤引起的頜骨缺損的修復重建中具有廣闊的前景。

APN 在顱頜面骨疾病領域有很大的臨床應用前景，但同時也面臨許多問題。1）臨床研究發現，體循環中APN 濃度與骨密度呈負相關，與骨折風險正相關。所以如何制定合理可行的治療方案，包括制定APN 的注射方式、劑量、次數等。2）研究發現，APN可能會成為治療骨質疏松的靶點，但是降低APN 濃度會增加冠心病、肥胖、高血壓、動脈粥樣硬化等疾病的風險。3）APN在不同疾病狀態、不同部位的成骨作用有異質性。因此，如何減少APN 應用的不良反應，增加APN 對BMSCs 調控效率及其具體機制等仍是以后研究需攻克的難點，探索改善機體干細胞修復潛能的手段，對顱頜面骨疾病的治療具有重要意義。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。