基于重水拉曼技術(shù)的氯己定對(duì)白色念珠菌抑菌效能的研究

李帆 張利娟 譚凱璇 張穎 盧潔 李?yuàn)檴?楊芳

1.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 青島266003；2.青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心 青島266071；3.大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 大連116044

氯己定（chlorhexidine，CHX）具有相當(dāng)強(qiáng)的廣譜抑菌、殺菌效果，對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌以及真菌均有效[1]。CHX 作為漱口水和根管沖洗液的添加成分，其效果較為確切[2]。臨床常用CHX 的藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%～2%。白色念珠菌，是口腔中最常分離到的條件致病真菌之一[3]，是口腔真菌感染中最常見的真菌種類[4]，也是持續(xù)性根管感染、難治性根尖周炎及根管治療失敗患者最常分離到的真菌種類[5]。

最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentra?tion，MIC）是定量評(píng)價(jià)藥物抑菌效能的金標(biāo)準(zhǔn)和重要指標(biāo)[6]，但在該濃度下，微生物生長(zhǎng)雖受到抑制，細(xì)胞代謝的抑制情況卻不清楚。重水標(biāo)記的單細(xì)胞拉曼顯微光譜技術(shù)，是重水標(biāo)記技術(shù)和拉曼技術(shù)的結(jié)合。重水可以使有代謝活性微生物的拉曼圖譜中特定區(qū)域（2 040～2 300 cm?1）出現(xiàn)重水峰（C?D 峰），基于ΔC?D ratio ［（當(dāng)前時(shí)間與0 h 的C?D ratio（重水峰所占比例）差值］測(cè)定的最小代謝活性抑制濃度（minimum inhibitory con?centration based on metabolic activity，MIC?MA）[7?8]能定量評(píng)價(jià)藥物對(duì)微生物實(shí)時(shí)代謝活性的影響[8]。該技術(shù)已普遍應(yīng)用于微生物種類鑒別的研究[7]，也曾廣泛用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)菌代謝活性的影響[8]，但有關(guān)藥物對(duì)真菌代謝活性影響的相關(guān)文獻(xiàn)及研究還非常少見。

系統(tǒng)了解CHX 對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)及代謝活性的影響有利于全面了解白色念珠菌的藥敏性，指導(dǎo)臨床合理使用藥物，減少耐藥菌株的產(chǎn)生及疾病反復(fù)感染和治療失敗的發(fā)生概率。本研究采用肉湯稀釋法和重水拉曼技術(shù)，研究重水對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的影響及該菌對(duì)重水的吸收規(guī)律，以評(píng)價(jià)重水拉曼技術(shù)的普適性；同時(shí)測(cè)定CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC 和MIC?MA，評(píng)價(jià)CHX 對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)及代謝的抑制效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與菌株培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株白色念珠菌CICC32380 購自中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心；SDA 固體培養(yǎng)基，以蛋白胨10 g、瓊脂20 g、葡萄糖40 g加蒸餾水定容至1 L，115 ℃下高溫滅菌20 min，趁熱倒入培養(yǎng)皿，凝固后備用；RPMI1640培養(yǎng)基用無菌雙蒸水溶解，每1 L 加入2 g NaHCO3，用HCl 和NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 為7.0，過膜濾菌，備用；質(zhì)量分?jǐn)?shù)19%～21%CHX，購自青島漢爵生物技術(shù)有限公司。

實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng)：將白色念珠菌CICC32380劃線接種到Y(jié)PD 固體培養(yǎng)基，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，取白色念珠菌菌落，轉(zhuǎn)種到RPMI1640液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min?1搖床中培養(yǎng)12 h，備用。

1.2 重水拉曼技術(shù)普適性評(píng)價(jià)

1.2.1 重水環(huán)境對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的影響 與其他同位素標(biāo)記物相比，重水價(jià)格便宜，對(duì)微生物干擾小[7]；但也有研究[9?10]表明，重水可能抑制細(xì)胞的活動(dòng)，本實(shí)驗(yàn)在重水環(huán)境中培養(yǎng)白色念珠菌，觀察對(duì)其生長(zhǎng)的影響。將實(shí)驗(yàn)菌株接種于含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0%、10%、20%、30%、40%、50%）重水的培養(yǎng)基中（0%為對(duì)照組）培養(yǎng)9 h，利用分光光度計(jì)（上海屹譜儀器制造有限公司）測(cè)定白色念珠菌吸光度值OD600隨時(shí)間的變化，檢測(cè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水對(duì)其生長(zhǎng)的影響。

1.2.2 白色念珠菌對(duì)重水的吸收規(guī)律 另取上述接種于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水中的實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)12 h，于不同時(shí)間點(diǎn)（0、1、2、3、4、6、8、12 h）分別取樣進(jìn)行拉曼技術(shù)檢測(cè)，以評(píng)價(jià)該菌株對(duì)重水的吸收規(guī)律。

1.3 采用肉湯稀釋法測(cè)定CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC

取YPD 固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24 h 的菌落，置于5 mL 無菌水中，渦旋15 s；調(diào)整菌密度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)，稀釋1 000 倍，最終菌密度為每毫升1 000～5 000 個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組：只含培養(yǎng)基，以排除培養(yǎng)基污染的可能性；陰性對(duì)照組：含有培養(yǎng)基+實(shí)驗(yàn)菌，以證明實(shí)驗(yàn)菌株可以在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好；實(shí)驗(yàn)組：含有培養(yǎng)基+實(shí)驗(yàn)菌+不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CHX。實(shí)驗(yàn)組中，通過調(diào)整培養(yǎng)基和CHX 配比，使CHX 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最終為32、16、8、4、2、1 μg·mL?1。37 ℃溫度下培育24 h，利用分光光度計(jì)分別測(cè)量0 h 和24 h 的OD600值，計(jì)算ΔOD600（0 h 和24 h 的OD600吸光度值的差值），ΔOD600≤0.05對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度，即CHX對(duì)白色念珠菌的MIC[11]。

1.4 采用重水拉曼技術(shù)測(cè)定CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC?MA

將實(shí)驗(yàn)菌株接種至含0、2、4、8、12 μg·mL?1CHX的RPMI1640培養(yǎng)基（含30%重水）中，37 ℃培養(yǎng)8 h，按時(shí)間梯度取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取0.2μL測(cè)量樣品點(diǎn)在CaF2玻片上，風(fēng)干。利用LabRam HR 型的改良后共聚焦拉曼熒光顯微鏡（Shelab 公司，美國(guó)）采集拉曼圖譜（參數(shù)設(shè)定如下：激光源為532 nm 的Nd:YAG 激光，樣品上激光強(qiáng)度為50 mW，照射時(shí)間1 s，分光光柵300 grooves·mm?1，拉曼圖譜范圍400～3 500 cm?1），在不同視野中隨機(jī)采集30～50 個(gè)細(xì)胞的拉曼圖譜。圖譜經(jīng)過減背景、基線歸一化和最大值標(biāo)準(zhǔn)化處理，即可計(jì)算出C?D ratio值。計(jì)算ΔC?D ratio（培養(yǎng)8 h與0 h的C?D ratio 差值），當(dāng)ΔC?D ratio≤0 且標(biāo)準(zhǔn)差＜0.005即為CHX對(duì)白色念珠菌的MIC?MA[8]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)中定量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用T檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 重水拉曼技術(shù)普適性評(píng)價(jià)

2.1.1 重水環(huán)境對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的影響 白色念珠菌在含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水環(huán)境下的生長(zhǎng)狀態(tài)見圖1。生理狀態(tài)下，白色念珠菌的生長(zhǎng)過程包括延遲期（0～2 h）、對(duì)數(shù)期（2～8 h）、穩(wěn)定期（8～9 h）；與對(duì)照組相比，白色念珠菌在10%～30%重水中生長(zhǎng)沒有受到明顯抑制（P＞0.05）；在40%～50%重水中，生長(zhǎng)則受到明顯抑制（P＜0.05）。該結(jié)果提示，白色念珠菌能夠耐受30%的重水，重水的毒性并不是本實(shí)驗(yàn)的限制性因素。

2.1.2 白色念珠菌對(duì)重水的吸收規(guī)律 白色念珠菌在含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水環(huán)境中培養(yǎng)12 h，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拉曼檢測(cè)的結(jié)果見圖2 和圖3。與對(duì)照組相比，10%重水環(huán)境下，即出現(xiàn)C?D 峰（圖2）；且C?D ratio 與重水質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正相關(guān)關(guān)系（R2=0.989 4，P＜0.05；圖3）。該結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)菌株能活躍代謝重水并通過拉曼圖譜檢測(cè)到，因此本研究選擇不影響實(shí)驗(yàn)菌株生長(zhǎng)又能產(chǎn)生明顯C?D 峰的重水質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即30%重水作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的默認(rèn)重水質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖1 白色念珠菌CICC32380在含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水中OD600隨時(shí)間的變化Fig 1 Temporal change of OD600 for Candida albicans CICC32380 under various quality score D2O

圖2 含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水環(huán)境下白色念珠菌CICC32380 的單細(xì)胞拉曼圖譜變化Fig 2 Change of single cell Raman spectrum for Candida albicans CICC32380 under various quality score D2O

白色念珠菌在30%重水環(huán)境中，其C?D ratio及OD600隨時(shí)間的變化趨勢(shì)見圖4和圖5。C?D峰在加入重水后迅速出現(xiàn)并快速升高，1 h 即有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），而吸光度值OD600在2 h 才發(fā)生明顯升高，其變化晚于C?D ratio變化曲線至少1 h。基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，拉曼圖譜技術(shù)用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)真菌代謝活性的影響時(shí)，敏感性更高且省時(shí)。

2.2 CHX對(duì)白色念珠菌的MIC測(cè)定結(jié)果

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC 測(cè)定結(jié)果見表1，ΔOD600≤0.05 對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度，即CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC。空白對(duì)照組在培養(yǎng)0 h 與24 h 的吸光度差值（ΔOD600）未發(fā)生明顯變化，可以排除培養(yǎng)基污染的可能。陰性對(duì)照組OD600的變化明顯，表明實(shí)驗(yàn)菌株活力良好。CHX質(zhì)量濃度分別為1、2μg·mL?1時(shí)，ΔOD600＞0.05；而當(dāng)CHX 質(zhì)量濃度為4、8、16、32μg·mL?1時(shí)，ΔOD600≤0.05。由此可見，CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC為4 μg·mL?1。

圖3 穩(wěn)定期白色念珠菌CICC32380 單細(xì)胞拉曼圖譜中C?D ratio與重水質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間呈線性關(guān)系Fig 3 There was a linear relationship between the C?D ratio of Candida albicans CICC32380 at stable stage and D2O concentra?tion followed by single cell Raman spectrum measurement

圖4 30%重水環(huán)境下白色念珠菌CICC32380 隨時(shí)間變化的單細(xì)胞拉曼圖譜Fig 4 Temporal change of single cell Raman spectrum for Candida albicans CICC32380 under 30%D2O

2.3 CHX對(duì)白色念珠菌MIC?MA的測(cè)定

CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC?MA 測(cè)定結(jié)果見表2 和圖6。與陰性對(duì)照組相比，CHX 在0.5×MIC（2 μg·mL?1）及MIC（4 μg·mL?1）時(shí)，ΔC?D?ratio＞0且未見明顯降低（P＞0.05）；在2×MIC 及3×MIC（8 μg·mL?1及12 μg·mL?1）時(shí)，ΔC?D?ratio＜0 且標(biāo)準(zhǔn)差＜0.005，ΔC?D ratio 值明顯降低（P＜0.001）。由此可見，CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC?MA 為8 μg·mL?1，即2×MIC。當(dāng)CHX≤4 μg·mL?1，C?D ratio 隨時(shí)間的變化趨勢(shì)與陰性對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05），而CHX＞4 μg·mL?1，C?D ratio 在8 h 內(nèi)甚至24 h 內(nèi)均維持在基線水平（圖7），說明該質(zhì)量濃度下，藥物作用發(fā)揮迅速，實(shí)驗(yàn)菌株的代謝活動(dòng)瞬時(shí)即可受到完全的抑制，并在一定時(shí)間內(nèi)未見恢復(fù)代謝活性。

圖5 30%重水環(huán)境下白色念珠菌CICC32380 C?D ratio 曲線和生長(zhǎng)曲線隨時(shí)間的變化Fig 5 Temporal change of C?D ratio curve and growth curve of Candida albicans CICC32380 under 30%D2O

表1 CHX對(duì)白色念珠菌CICC32380的MIC測(cè)定結(jié)果Tab 1 Measurement of MIC for Candida albicans CICC32380 under CHX

表2 CHX對(duì)白色念珠菌CICC32380的MIC-MA測(cè)定結(jié)果Tab 2 Measurement of MIC-MA for Candida albicans CICC32380 under CHX

圖6 CHX對(duì)白色念珠菌CICC32380的MIC?MA測(cè)量Fig 6 Measurement of MIC?MA under CHX for Candida albicans CICC32380

圖7 C?D ratio在不同質(zhì)量濃度CHX作用下的時(shí)間曲線Fig 7 Temporal dynamics of the C?D ratio under various quality score CHX

3 討論

本研究確定了CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC 及MIC?MA，通過探討CHX 對(duì)微生物生長(zhǎng)及代謝的影響，系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了CHX 對(duì)白色念珠菌的抑菌效能；同時(shí)，本研究建立了藥物對(duì)真菌代謝活性的作用模型，為后期評(píng)價(jià)口腔常見藥物對(duì)微生物抑菌效能研究提供了參考依據(jù)。

CHX 對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的抑制效果已有諸多報(bào)道[12?13]。Ferguson等[12]報(bào)道，CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC＜0.63 μg·mL?1；Estrela等[13]則 發(fā) 現(xiàn)MIC 為0.2 μg·mL?1。本實(shí)驗(yàn)探索的MIC 與以往報(bào)道有所差別，分析原因可能是在實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的亞種、培養(yǎng)基組成、儀器設(shè)備及實(shí)驗(yàn)者操作等多種差異造成的。

在以往的研究中，評(píng)價(jià)藥物對(duì)微生物的抑菌效能均是基于肉湯稀釋法，參考MIC 指標(biāo)僅考慮其對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制效能，耗時(shí)且不能評(píng)價(jià)不生長(zhǎng)但有代謝活性（nongrowing but metabolically active，NGMA）細(xì)胞[14]的抑菌效能。本實(shí)驗(yàn)顯示，菌株在MIC 下生長(zhǎng)受到抑制，但仍具有很高的代謝活性，與前期相關(guān)研究[8]中CHX 對(duì)變異鏈球菌、血鏈球菌、發(fā)酵乳桿菌等細(xì)菌代謝活性影響的研究結(jié)果相似。在基于重水拉曼技術(shù)的MIC?MA 下，白色念珠菌的生長(zhǎng)不僅受到完全抑制，代謝活性也瞬時(shí)受到完全抑制，并且在一定時(shí)間內(nèi)，未見代謝活性的恢復(fù)。本研究通過重水拉曼技術(shù)發(fā)現(xiàn)了真菌的NGMA 細(xì)胞，此種細(xì)胞可能是疾病反復(fù)感染甚至治療失敗的重要原因[15]。

以往多采用二甲氧唑磺比色法檢測(cè)細(xì)胞代謝活性，然而該方法存在溶液的不穩(wěn)定性、培養(yǎng)體系中過氧化物及某些代謝產(chǎn)物影響結(jié)果準(zhǔn)確性等因素，從而限制了該方法的應(yīng)用[16]。重水標(biāo)記的單細(xì)胞拉曼顯微光譜技術(shù)，能夠在不改變細(xì)胞組分、不依賴細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，減少對(duì)細(xì)胞的損傷及人為干擾因素，達(dá)到在單細(xì)胞的水平快速、定量、無損地評(píng)價(jià)藥物對(duì)微生物實(shí)時(shí)代謝活性的影響[7?8,17]。同時(shí)，通過該技術(shù)測(cè)得的拉曼圖譜包含的信息相當(dāng)豐富，可以反映出物質(zhì)的生化及結(jié)構(gòu)特性，理論上能夠覆蓋細(xì)胞內(nèi)所有物質(zhì)的圖譜，特別是600～1 800 cm?1范圍的“指紋區(qū)”[18]，可以區(qū)分細(xì)胞類型、探討微生物應(yīng)激機(jī)制等，具有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景及重要的指導(dǎo)意義。

CHX 是一種帶正電荷的親水親脂分子，可與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁之間的靜電相結(jié)合，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白的沉淀和凝固，同時(shí)也可導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性發(fā)生改變，使低相對(duì)分子質(zhì)量的胞內(nèi)成分發(fā)生滲漏，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)及代謝活動(dòng)。CHX 作為口腔常用藥物，具有低細(xì)胞毒性的特點(diǎn)；但CHX 在使用過程中仍可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)，舌、義齒、牙齒著色以及味覺改變等不良反應(yīng)，其發(fā)生概率隨質(zhì)量濃度的增高而增大[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC 和MIC?MA，遠(yuǎn)低于臨床常用濃度（0.12%～2%，即1.2～20 g·L?1）。該結(jié)果提示，盡管在臨床使用過程中，CHX 可能被稀釋，但對(duì)白色念珠菌的生長(zhǎng)及代謝仍具有很好的抑制作用，甚至稀釋近千倍仍然具有良好的效果。

本研究采用重水標(biāo)記的單細(xì)胞拉曼顯微光譜技術(shù)探討真菌藥敏性和CHX 對(duì)白色念珠菌代謝的影響，技術(shù)手段先進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)建立了藥物對(duì)真菌代謝活性影響的模型，為后期評(píng)價(jià)口腔常見藥物對(duì)微生物抑菌效能的研究提供了參考，可以指導(dǎo)臨床快速篩選藥物，達(dá)到盡快篩選出高效低毒、安全有效且不易產(chǎn)生耐藥菌的目的。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。