中國擬青霉液體深層發酵條件的優化

周家萍，孟夢，夏國強

（1.天津科技大學現代分析技術研究中心，天津 300457；2.天津科技大學食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；3.天津科技大學食品科學學院，天津 300457；4.優滋福（天津）食品科技有限公司，天津 300457）

中國擬青霉（Paecilomyces sinensis sp nov，PS）是從蟲草中分離后，進行發酵培養的無性型菌株[1]。并且中國擬青霉與天然蟲草相比，藥理學、形態學[2]及所含的有效化學成分極為相似[3]。因此從中國擬青霉中分離出具有生物活性的菌體對蟲草的研究與應用具有非常重要的意義。與傳統的食藥用真菌生產方式相比，真菌液體深層發酵技術有更為明顯的優點[4]。研究人員對真菌進行液體發酵培養后，通過對其菌絲體進行檢測，結果表明其菌絲體與該真菌的野生型子實體相比，生物活性物質的組成十分相似[5]。在真菌液體發酵培養過程中，不僅菌絲體會大量增殖，其發酵液中也會產生很多生理活性物[6]。因此，研究真菌液體深層發酵技術的意義重大[7]。本文以中國擬青霉為原材料，研究其培養基成分及發酵條件不同對中國擬青霉液體深層發酵產生的影響，從而優化了中國擬青霉液體深層發酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中國擬青霉（Paecilomyces sinensis）：保存于天津科技大學菌種保藏中心。

葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、果糖、麥芽糖、蛋白胨、酵母粉、氯化銨、硝酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、三氟乙酸：分析純，天津市北方天醫化學試劑廠；乙醇、丙酮、乙醚、濃硫酸、冰醋酸、無水葡萄糖、鹽酸：分析純，天津化學試劑一廠；Sepharose 4B：上海Pharmacia拜力公司；透析袋（COMW 7000）：北京Sorlabio生物科技公司。

1.2 儀器與設備

SQ810C高壓蒸汽滅菌鍋：日本雅瑪拓公司；DGG-102-2BS電熱鼓風干燥箱：天津天宇機電有限公司；FE28 pH測定計：瑞士Mettler Toledo有限公司；BSA822電子天平：美國Sartorius公司；EPOCH酶標儀：美國BioTek公司；SP88857195磁力攪拌器：美國Thermo Fisher公司；Vortex渦旋振蕩混合器：德國IKA公司；KQ5200DB超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；5920R冷凍高速離心機：德國Eppendorf公司；UV-2550PC紫外可見分光光度計：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化及培養

在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上接種保存的中國擬青霉母種，將其置于25℃培養箱中進行培養，菌絲長滿斜面后備用。從斜面上挑取活化好兩塊菌絲體，將其接入到裝有液體種子培養基的三角瓶中，置于25℃的搖床上振蕩，從而獲取一級種子液。將菌絲體打碎，將一級種子液接入到裝有液體種子培養基的三角瓶中，置于25℃的搖床上振蕩4 d，從而獲取二級種子液。最后將種子液接入裝有發酵培養基的三角瓶中，將其置于25℃的搖床中振蕩培養5 d。

1.3.2 中國擬青霉液體深層發酵培養基的優化

1.3.2.1 碳源、氮源的單因素篩選試驗

碳源篩選試驗：葡萄糖分別以4.0%的玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、果糖替代；氮源篩選試驗：蛋白胨分別以酵母粉、黃豆粉、麩皮、硝酸銨、氯化銨替代，含量以0.5%蛋白胨的全氮含量計。各組設計3個重復，然后進行發酵培養。

1.3.2.2 碳源、氮源正交試驗

根據碳源與氮源的單因素篩選的結果，選擇試驗結果較好的碳源、氮源各兩個，設計L9（34）正交試驗，發酵培養條件同1.3.2.1，每組設3個重復，如表1所示。

表1 碳源、氮源正交試驗設計表Table 1 Scheme of carbon and nitrogen source in orthogonal test

1.3.2.3 無機鹽正交試驗

根據最佳碳源、氮源培養基的試驗結果，選取KH2PO4、MgSO4、CaSO4、ZnSO4，設計L9（34）正交試驗，發酵條件同1.3.2.1，每組設3個重復，如表2所示。

表2 無機鹽正交試驗設計表Table 2 Scheme of inorganic saltin in orthogonal test

1.3.3 菌絲體生物量的測定

首先過濾液體發酵所得菌體，再用蒸餾水反復漂洗菌體，將洗好的菌體放置于預處理好的玻璃平皿上，在60℃恒溫的鼓風干燥箱干燥至質量不發生改變為止，將其放在分析天平稱重，然后減去玻璃平皿的質量，即為發酵液菌體的質量，最后除以該發酵液的體積，即為生物量。每組重復3次，取平均值[8]。

1.3.4 胞內糖肽的測定

1.3.4.1 胞內糖肽的提取

將烘干的菌絲體粉碎，過篩后稱取1.0 g，加入100 mL的蒸餾水，在90℃條件下水浴提取2 h，然后7 000 r/min離心20 min，取上清液，50℃條件下進行旋蒸，加入無水乙醇，在4℃條件下放置24 h進行醇沉，6 000 r/min離心15 min，沉淀經sevage法除蛋白沉淀60℃真空干燥至恒重，即得中國擬青霉胞內糖肽粗品，命名為CPS-Ⅰ。

1.3.4.2 糖含量的測定

標準曲線的繪制：稱取干燥的無水葡萄糖標準品，配成50 mL的100 μg/mL的標準溶液。分別吸取標準溶液 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 放于具塞比色管中，以超純水補至1mL，然后加入6%苯酚500μL，混勻，迅速加入濃硫酸2.5 mL，搖勻后沸水浴處理15 min，冷水浴冷卻后于490 nm處測吸光度，以葡聚糖濃度（mg/mL）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得標準回歸方程。標準曲線線性回歸方程為：y=4.577 9x+0.004（R2=0.999）。

圖1 葡聚糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucanase

1.3.4.3 換算系數的計算

糖肽粗品組成成分不單一，單糖組分也不單一，這些單糖經苯酚-硫酸法顯色后吸光度也不完全一樣，而制作標準曲線時采用的是單一葡萄糖為標準品，這樣會存在一定的誤差，因此需用換算因子f加以校正。

理論CPS-Ⅰ質量：稱取5mgCPS-Ⅰ定容至50mL，分別取1.0 mL到3支具塞試管中，按1.3.4.2方法顯色，于490 nm波長處測定吸光度，以1.0 mL蒸餾水為空白。最后根據回歸方程計算理論CPS-Ⅰ含量。

2 結果與分析

2.1 最佳碳源的選擇

碳源對中國擬青霉液體發酵的影響見圖2。

碳源是發酵培養基的重要優化因素之一，同時也是細胞生命活動所需的主要能量來源[9]。由圖2可知，中國擬青霉菌絲體都可利用這6種碳源，表明中國擬青霉既可利用復合碳源，也可利用小分子碳源。其中以菌絲體生物量為指標時，以玉米粉、葡萄糖和可溶性淀粉最佳，分別為6.19、5.37 mg/mL和4.81 mg/mL，其次是麥芽糖和蔗糖，分別為3.25 mg/mL和2.42 mg/mL，果糖最少，為1.28 mg/mL。以胞內糖肽產量為指標時，玉米粉和葡萄糖較佳，分別為0.957、0.891 mg/mL，其次是可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖和果糖，分別為0.837、0.721、0.062 3 mg/mL和0.045 8 mg/mL。由于玉米粉價格低，來源廣，因此最終選擇玉米粉；同時菌體可直接利用葡萄糖，將發酵周期縮短。因此最終選擇玉米粉、葡萄糖作為正交試驗中的碳源。

圖2 碳源對中國擬青霉液體發酵的影響Fig.2 Effect of carbon sources on liquid fermentation of Paecilomyces sinensis

2.2 最佳氮源的選擇

氮源對中國擬青霉液體發酵的影響見圖3。

圖3 氮源對中國擬青霉液體發酵的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on liquid fermentation of Paecilomyces sinensis

有研究表明絕大多數的真菌培養基經過含有機氮源的培養基發酵后，與含無機氮源（硝酸鹽、銨鹽）的培養基相比，生物量和產量均得到一定程度的提升[10]。從圖3可以看出，中國擬青霉在含酵母粉、黃豆粉、蛋白胨、麩皮的培養基中均能得到較好的生長，而在含氯化銨、硝酸銨的培養基中生長較為緩慢，說明中國擬青霉對有機氮的利用比無機氮好。以菌絲體生物量和胞內糖肽產量為指標，以酵母粉作為氮源時效果最佳，分別為3.25、0.853 mg/mL，其次為黃豆粉，分別為2.78、0.741 mg/mL。由于黃豆粉價格低，來源廣，因此最終選擇黃豆粉，同時酵母粉作為生長因子，對菌體的生長有利并能夠使發酵周期有效縮短。因此，選擇黃豆粉和酵母粉作為氮源進行正交試驗。

2.3 碳源、氮源最佳組合的確定

碳、氮源正交試驗的結果見表3。以菌絲體生物量為指標的碳、氮源正交試驗結果的極差分析見表4，以胞內糖肽為指標的碳、氮源正交試驗結果的極差分析見表5。

表3 碳、氮源正交試驗的結果Table 3 Results of orthogonal experiments on carbon and nitrogen sources

表4 以菌絲體生物量為指標的碳、氮源正交試驗結果的極差分析Table 4 Analysis of orthogonal test on carbon and nitrogen sources with mycelial biomass as target

選取玉米粉（A）、葡萄糖（B）、黃豆粉（C）和酵母粉（D）作為正交試驗中的因素，從而篩選出培養基中碳源、氮源的最佳組合。由表3的結果可以看出，不同組合的選擇導致發酵的結果也不同。觀察表4、表5中極差分析可見，以菌絲體生物量為指標，極差順序為酵母粉＞玉米粉＞黃豆粉＞葡萄糖，極差數據為0.99、0.94、0.67、0.36。以胞內糖肽為指標，極差順序為酵母粉＞玉米粉＞葡萄糖＞黃豆粉，極差數據為0.35、0.31、0.26、0.21。兩種指標均表明酵母粉的濃度是對發酵影響最大的因素。對菌絲體生物量而言，應該選擇A2B2C3D3組合。以胞內糖肽產量而言，應選擇A2B2C2D3組合。由于黃豆粉（C）的影響對發酵的影響作用較小，故選擇組合A2B2C3D3或者A2B2C2D3相差并不大，但考慮到降低試驗成本，因此選擇黃豆粉（C）的水平為C2，試驗最終選擇組合A2B2C2D3，即玉米粉4.0%、葡萄糖1.5%、黃豆粉2.0%、酵母粉0.3%。在此最優組合下，菌絲體生物量為10.78 mg/mL，胞內糖肽為1.701 2 mg/mL。

表5 以胞內糖肽為指標的碳、氮源正交試驗結果的極差分析Table 5 Analysis of orthogonal test on carbon and nitrogen sources with glycopeptides as target

2.4 無機鹽最佳組合的確定

在確定碳源、氮源最佳組合后，選擇KH2PO4（E）、MgSO4（F）、CaSO4（G）、ZnSO4（H）4種無機鹽作為正交試驗中的因素，從而篩選出無機鹽的最佳組合。正交試驗結果見表6。以菌絲體生物量和胞內糖肽為指標的正交試驗極差分析見表7和表8。

由表6結果可知，不同組合的選擇導致發酵結果也是不同的。由表7、表8的極差分析可見，以菌絲體生物量為指標，極差順序為 CaSO4＞KH2PO4＞MgSO4＞ZnSO4，極差數據為 0.61、0.51、0.40、0.29。以胞內糖肽為指標，極差順序為 KH2PO4＞MgSO4＞CaSO4＞ZnSO4，極差數據為0.16、0.12、0.07、0.04。結果表明在中國擬青霉液體發酵過程中，CaSO4的濃度是對菌絲體生物量的影響最大的因素，而KH2PO4的濃度是對胞內糖肽得率的影響最大的因素。對菌絲體生物量而言，應當選擇組合E2F2G3H3，對胞內糖肽產量而言，應當選擇組合E2F2G1H3。由極差順序可知，CaSO4的濃度對發酵的影響作用較小，因此選擇組合E2F2G3H3、E2F2G1H3相差不大，考慮到降低試驗成本，因此選擇CaSO4（G）的水平選擇為G1，最終確定組合E2F2G1H3，選擇無機鹽的配比為：KH2PO40.2%，MgSO40.1%，CaSO40.1%，ZnSO40.03%。在此最優組合下，菌絲體生物量為11.02 mg/mL，胞內糖肽為2.012 5 mg/mL。

表6 無機鹽正交試驗的結果Table 6 Results of orthogonal tests on inorganic salts

表7 以菌絲體生物量為指標的無機鹽正交試驗結果的極差分析Table 7 Analysis of orthogonal test on inorganic salt with mycelial biomass as target

表8 以胞內糖肽為指標的無機鹽正交試驗結果的極差分析Table 8 Analysis of orthogonal test on inorganic salt with glycopeptides as target

3 結論

本文對中國擬青霉液體深層發酵工藝進行了優化，以發酵獲取的菌絲體生物量和胞內糖肽產量為指標，通過單因素篩選試驗和正交試驗，對碳源、氮源及無機鹽進行篩選，確定了中國擬青霉液體深層發酵的最優培養基配比為玉米粉4.0%、葡萄糖1.5%、黃豆粉2.0%、酵母粉 0.3%、KH2PO40.2%，MgSO40.1%，CaSO40.1%，ZnSO40.03%。本試驗在進行接種前將制備好的所有種子液混合到一個三角瓶中，然后將其接種到優化前的發酵培養基和優化后的發酵培養基分別發酵5 d。優化后的菌絲體生物量與優化前相比提高了1.22倍，而胞內糖肽產量與優化前相比提高了54.0%。