HPLC法測定中國白酒中的γ-氨基丁酸和核苷類物質

郭瑩，李景輝，李霄霄，李研科，王國明，尹翠娟，張翠英*

（1.省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.河北山莊老酒股份有限公司，河北 承德 067500）

中國白酒有悠遠的歷史，多以小麥、高粱、玉米、大米和豌豆等糧食作物為主要原料，經過制曲、蒸梁、拌料、堆積發酵和窖池發酵以及蒸酒等主要生產過程釀造而成[1]。環境中紛繁復雜的微生物類群經自然網羅進入釀酒基質體系，最終由發酵代謝出以乙醇為主體的品類繁多的有機化合物成分，賦予中國白酒特有的“香和味”[2]。白酒種類繁多，因香型差異可以將其劃分為清香型、濃香型、醬香型、米香型和其它各類香型。白酒是我國一種獨特的蒸餾酒，其釀造風格、口味獨特，且全球聞名，與世界其它著名蒸餾酒（如白蘭地、威士忌、朗姆酒等）齊名成為六大蒸餾酒之一[3]。

徐巖等[4-5]通過研究證明，中國白酒不等同于酒精，而是含有各類醇、醛、酸、酯等豐富的風味物質且具保健功能的混合飲品。此外，有研究[6-7]報導中國白酒對心腦血管疾病有保護作用，亦能提升機體抵抗氧化損傷的能力，同時阻止體內代謝不良產物的生成，這進一步證實了中國白酒具有保健功效。白酒的生產經歷了多種微生物的混合發酵過程，在這一過程中，微生物會代謝產生各種功能成分，如四甲基吡嗪、γ-氨基丁酸和核苷類物質等[7]。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）具有保護心血管功能、降低血壓、抗癲癇、鎮痛以及痛覺過敏等作用[8-11]，是有益于機體健康的氨基酸之一。此外，γ-氨基丁酸對胰島β細胞能發揮保護和再生作用，還可以促進腦細胞的新陳代謝與恢復，增強長期記憶[12-13]，還具有提高肝、腎機能等生理活性的功能[14]。核苷類化合物具有補益和增強免疫、保護神經、抗氧化、抗癌等生物活性，研究發現[15-16]，腺苷能顯著提高細胞活力，并在機體的中樞神經系統、心血管系統和凝血系統中發揮重要作用。尿苷具有促進睡眠和抗癲癇的作用，能改善記憶功能，影響神經元可塑性。

高效液相色譜法具有分離效能高、分析速度快、樣品用量少等優點，該方法已廣泛用于生物發酵中各種成分含量的測定，且使用的流動相簡單并具有良好的重現性[17-18]。本研究采用高效液相色譜法，通過對色譜檢測條件的優化，建立以高效液相色譜法定量分析中國白酒中γ-氨基丁酸和核苷類物質（腺苷、尿苷）的有效方法，并用所建方法對20種白酒中的上述功能成分進行了檢測與分析，為進一步標準化中國白酒的品質評價及開展相關研究奠定基礎，同時對指導中國白酒的生產改良、市場推廣和深入科學研究有積極的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

待測酒樣共20個，1號 ～9號白酒為河北山莊老酒；10號 ～20號白酒為市售酒樣。γ-氨基丁酸、腺苷標準品、丹磺酰氯（（純度均＞99%）、尿苷（純度≥98%）：美國Sigma公司；甲醇、乙腈（色譜純）：天津一方科技有限公司；乙酸鈉、碳酸氫鈉（分析純）：天津索羅門生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；EDAA-2300TH超聲波清洗器：上海安譜實驗科技股份有限公司；BSA224S電子分析天平：愛來寶醫療科技有限公司；HH-S6恒溫水浴鍋：上海一凱儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準品及樣品溶液的配制

1.3.1.1 標準品溶液配制

γ-氨基丁酸標準品溶液：準確稱取GABA的標準品10.00 mg置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成100 mg/L的γ-氨基丁酸標樣母液。隨后倍比稀釋，配制成 0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0、10、20 mg/L的系列標準溶液，現配現用。

核苷類物質標準品：精確稱取尿苷的標準品1.00mg和腺苷的標準品10.00 mg置于同一10 mL容量瓶中，用10%甲醇溶解并定容，可得尿苷濃度為100 mg/L和腺苷濃度為1 000 mg/L的混合標樣母液。倍比稀釋即可得到混合標準工作溶液中尿苷溶度為0.5、1.0、2.0、5.0、10 mg/L；腺苷濃度為 5、10、20、50、100 mg/L。

1.3.1.2 樣品溶液的配制

測定γ-氨基丁酸：測定前需對樣品衍生化處理，準確吸取1 mL的酒樣或標準溶液置于具塞試管中，加入0.20 mL的碳酸氫鈉溶液和0.40 mL的丹磺酰氯衍生試劑，混勻后在70℃水浴中反應20 min，用0.22 μm的微孔濾膜過濾后待測。

測定核苷類物質：取2 mL酒樣用0.22 μm的微孔濾膜過濾后待測。

1.3.2 檢測方法

色譜柱：Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測γ-氨基丁酸的流動相A為乙腈，B為50 mmol/L三水合乙酸鈉；檢測核苷類物質流動相A為甲醇，B為水，具體色譜條件見表1。

表1 色譜條件Table 1 The chromatographic conditions

1.3.3 標準曲線繪制

取1.3.1.1中的系列標準工作溶液在1.3.2相應的色譜條件下進行測定，以標準物濃度（C）為橫坐標，其對應峰面積值（S）為縱坐標，分別建立γ-氨基丁酸和核苷類物質的標準曲線。

1.3.4 精密度試驗

取0.50 mg/L的γ-氨基丁酸標準品和核苷類物質混合標準品（尿苷：1.00 mg/L；腺苷：10.00 mg/L）各6份，分別在1.3.2相應的色譜條件下測定含量，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5 加標回收率試驗

取2號酒樣分別添加0.5、1.0、2.0 mg/L的3種濃度的γ-氨基丁酸標準品，隨后衍生化處理；另取2號酒樣添加尿苷濃度分別為1、2、5 mg/L，腺苷濃度分別為10、20、50 mg/L混合標準工作溶液，以上加標樣品均用0.22 μm的微孔濾膜過濾后，在1.3.2相應的色譜條件下重復測定3次，計算加標回收率和相對標準偏差。

1.3.6 數據處理

色譜數據分析采用儀器自帶軟件Agilent Chem－Station進行處理。所有線性方程、精密度及回收率試驗的數據均由Office Excel 2016處理得出。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

γ-氨基丁酸色譜條件的優化：通過對γ-氨基丁酸標準樣品的全波長掃描發現，γ-氨基丁酸在436 nm處具有最大吸收峰，因此確定檢測波長為436 nm。本試驗分別采用50%、55%、60%、65%、70%、75%這6種比例的流動相B進行試驗。結果顯示，當流動相B為65%時，γ-氨基丁酸的峰型對稱，基線穩定。當流速由0.6 mL/min逐漸遞增到1.2 mL/min時，γ-氨基丁酸的峰均能分離，但峰保留時間變短且柱壓出現波動式變化，使得峰型較差。當流速為1.0 mL/min時，柱壓穩定，色譜峰保留時間未發生偏移且峰型最佳。本試驗發現在4種不同的柱溫條件下，γ-氨基丁酸的分離效果均較好，說明柱溫對其影響較小。綜合峰型、對色譜柱的保護和柱壓穩定性的因素，確定了最佳色譜檢測條件：進樣量5 μL，流動相A∶B=35∶65（體積比），流速為1.0mL/min，柱溫 40℃，檢測波長為436 nm。該色譜條件下γ-氨基丁酸標準溶液的色譜圖見圖1。

圖1 γ-氨基丁酸標準溶液色譜圖Fig.1 The GABA standard solution chromatogram

由圖1可知，GABA的保留時間為5.321 min。

核苷類物質檢測色譜條件的優化：查閱測定核苷類物質的相關文獻[19]，確定色譜檢測波長為254 nm；本試驗分別采用10%、20%、30%、40%、50%這5種甲醇濃度的流動相，發現隨著甲醇濃度的升高，腺苷、尿苷與樣品中其他組分的分離度降低，出現峰分裂和小峰的現象。當甲醇濃度為10%時，樣品中腺苷、尿苷的峰型良好，分離度高，且無拖尾現象。另外，本文考察了0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min 這 4 種流速下的分離效果，結果發現在這4種流速下，腺苷和尿苷都完全分離，流速增大雖改善了標準色譜峰與雜質峰的分離度，但流速過高會使峰形變差，柱壓顯著波動。發現柱溫在30℃到50℃之間對色譜峰型與分離效果無明顯影響。綜合上述結果，確定了最佳色譜檢測條件：進樣量10 μL，流動相10%甲醇，體積流量為0.8 mL/min，柱溫40℃，檢測波長為254 nm。該色譜條件下核苷類物質混合標準溶液的色譜圖見圖2。可知，尿苷、腺苷的保留時間分別為 4.191、11.625 min。

2.2 標準曲線

將γ-氨基丁酸的系列標準溶液以及尿苷和腺苷的混合系列標準溶液分別在2.1的色譜條件下測定，以標準品的濃度為橫坐標（C），標準品峰面積為縱坐標（S），繪制標準曲線，得回歸方程，結果見表2。

圖2 核苷類物質標準溶液色譜圖Fig.2 The two nucleoside substances standard solution chromatogram

表2 回歸曲線、相關系數、線性范圍Table 2 The standard curve，correlation index，linearity range

由表2可知，所測物質線性相關系數R2≥0.995。采用此方法γ-氨基丁酸在0.1mg/L ～20 mg/L具有良好的線性，尿苷在0.5 mg/L ～100 mg/L具有良好的線性，腺苷在5 mg/L ～1 000 mg/L具有良好的線性，完全滿足試驗要求。

2.3 精密度試驗

通過標準曲線得γ-氨基丁酸、腺苷和尿苷含量，計算相對標準偏差值，結果見表3和表4。

表3 γ-氨基丁酸精密度試驗結果（n=6）Table 3 Results of GABA precision detection（n=6）

由表3和表4可知，γ-氨基丁酸的RSD值為2.37%，尿苷的RSD為1.76%，腺苷的RSD為1.99%，均＜5%，可見此法的精密度良好，滿足分析要求。

2.4 加標回收率

γ-氨基丁酸和核苷類物質的加標回收率結果分別見表5和表6。

由表5和表6可知，GABA加標回收率在97.93% ～99.72%之間，核苷類物質回收率在97.90% ～101.15%，RSD均<5.0%，表明本方法準確可靠，可以滿足測定的要求。

表4 核苷類物質精密度試驗結果（n=6）Table 4 Results of nucleoside substances precision detection（n=6）

表5 GABA加標回收率試驗結果（n=3）Table 5 Results ofGABA adding standard recovery rate tests（n=3）

表6 核苷類物質加標回收率試驗結果（n=3）Table 6 Results of nucleoside substances adding standard recovery rate tests（n=3）

2.5 樣品測定

應用2.1確定的色譜條件對20種白酒進行測定見表7。

γ-氨基丁酸在20種白酒中的含量在0.102 mg/L ～0.867mg/L之間，其中醬香型白酒的含量在0.143 mg/L ～0.188 mg/L之間，濃香型白酒的含量在0.102 mg/L ～0.867 mg/L之間，芝麻香型白酒和部分醬香型白酒中未檢測到。李波等[20]發現GABA在發酵過程中可以作為酵母的氮源被酵母很好的利用。部分白酒中未檢測到GABA，可能是由于在發酵過程中被消耗，進而未檢測出。此外，1號 ～9號白酒中濃香型白酒GABA的含量在0.239 mg/L ～0.867 mg/L之間，高于醬香型白酒，同時也高于大部分市售酒樣。2號濃香型白酒中GABA的含量最高，達到0.867 mg/L，其次為1號酒樣達到0.659 mg/L。因2號樣品儲存時間相比其他樣品久，在本次試驗中，儲存時間越長，GABA的含量越高。但儲存時間的長短與GABA的含量之間是否有一定的規律性還需進行大量試驗驗證。

表7 樣品測定結果Table 7 The results of samples

酒樣中核苷類成分檢測率為100%，檢測到20種白酒中腺苷的含量在10.043 mg/L ～433.460 mg/L之間，尿苷的含量在0.580 mg/L ～8.657 mg/L之間。相比于醬香型和濃香型白酒，芝麻香型白酒中腺苷的含量較高，9號達到433.460 mg/L。醬香型白酒中尿苷含量最高，4號達到8.657 mg/L；其次為芝麻香型白酒，濃香型白酒含量最低。測定結果表明，該酒廠中醬香型（4號 ～6號）和芝麻香型（8號、9號）白酒中這兩種核苷類物質含量高于市售酒樣，而濃香型白酒（1號 ～3號）則與市售酒樣相差不大。

可見，不同香型酒之間GABA和核苷類物質的含量均存在差異。研究報道[21-23]，釀造工藝（如原料、酒曲等）對發酵產品中GABA的含量影響顯著。不同香型白酒釀造工藝不同，各地氣候、環境及微生物的差異很大，但釀造工藝是如何使得不同白酒中GABA、核苷類物質在含量上產生以上差異還需要進一步探究。核苷類物質含量差異與制曲、堆積工藝等關系也需進一步的研究。因此，采用簡便快捷的方法測定白酒中的GABA和核苷類物質，對未來探究不同香型白酒中GABA和核苷類物質差異原因有著重要意義。

3 結論

本文建立利用高效液相色譜法精確測定白酒中GABA以及核苷類物質（尿苷、腺苷）的方法，并對20種白酒其功能成分進行測定，發現不同種類的白酒中含量不盡相同。20種白酒中GABA的含量在0.102 mg/L ～0.870mg/L之間，腺苷的含量在10.043mg/L ～433.460mg/L之間，尿苷的含量在0.580 mg/L ～8.657 mg/L之間。分析結果顯示，GABA在濃香型白酒中較高，核苷類物質在芝麻香型和醬香型白酒中要高于濃香型白酒。本研究通過對色譜條件的優化以及對精密度、回收率的測定，充分證明了試驗的可行性，具有較高的參考價值。本文建立的方法操作簡便，靈敏度高，適用范圍廣，適用于大量樣本的測定，為后期探索功能成分合成機制以及釀造工藝如何影響其在白酒中的含量奠定了技術基礎。