木瓜蛋白酶酶解制備豌豆蛋白自由基清除肽(1)

張樹成 楊進潔

摘要：本研究以豌豆蛋白為原料，選用木瓜蛋白酶對其進行酶解，利用響應曲面設計優化選取最佳的酶解條件。豌豆蛋白木瓜蛋白酶酶解最佳條件：加酶量12.1%（E/S）、溫度60.2℃、pH 6.46、底物濃度7.15%（g/ml）。此條件下，最佳.O2.- 清除率為64.0%。經驗證，所建模型預測準確可靠，酶解產物自由基清除率高，為相關生產和工藝產品開發提供參考價值。酶解液經透析分離，自由基清除率能力最強的酶解肽分子量小于1 KDa，說明酶解后得到的肽大多是2～8肽，.O2.-清除率為65.3±0.22%。經顯著性分析發現透析能夠顯著提高抗氧化肽的純化率，提高抗氧化肽對自由基的清除能力。

關鍵詞：豌豆蛋白;木瓜蛋白酶;酶解;自由基清除率

豌豆（Pea）是我國的主要農作物之一。豌豆富含淀粉、蛋白質、纖維素及多種微量元素。具有調和脾胃、抗菌消炎、防癌治癌、促進腸道蠕動等功效。豌豆的種植面積廣，價格低廉，在我國擁有相當豐富的資源，存在著極大的開發潛能。近年，酶解豌豆蛋白生成活性肽，比如抗氧化、降血壓等，逐步成為研究熱點。本實驗室研究發現豌豆蛋白木瓜蛋白酶酶解產物DPPH清除率達98.2%，是一個很好的抗氧化肽資源。

我國對于豌豆的利用以淀粉為主，其對蛋白質的利用率較低。但在現階段，豌豆蛋白的綜合利用成為了國際上的一個研究熱點。與其他豆科植物相比，豌豆富含賴氨酸，世界衛生組織推薦值的1.5倍。但其蛋氨酸和胱氨酸的含量較低，僅為推薦值的四分之一和五分之一。

除此以外，國際上現研究，豌豆蛋白通過酶解所獲得的豌豆蛋白肽具有一些活性功能。比如，Ndiaye等人研究發現豌豆酶解液具有抗氧化、降低炎癥和免疫調節的作用。而Huan Li等人的研究則表明，豌豆蛋白酶解后的產物為陽離子多肽，該多肽可以有效調節Ca MK II的活性，因而可以作為保健品被利用于心血管疾病的預防方面。Samson等人則發現豌豆蛋白可以抑制ACE酶的活性，從而起到降血壓的作用。

酶法酶解生產抗氧化活性肽大多采用蛋白質酶解的方式。在酶解過程中，主要運用動物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶。本文采用了木瓜蛋白酶對豌豆蛋白進行酶解。

本研究旨在以自由基清除能力作為抗氧化活性的評價指標，通過響應曲面實驗設計建立豌豆蛋白酶解條件預測酶解產物自由基清除率模型，以及最佳酶解條件和酶解產物，從而為豌豆蛋白的開發利用和加工拓寬思路、提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木瓜蛋白酶購自濟寧元素高科生物科技有限公司，木瓜蛋白酶的酶活力為50234 u/g。甲醛溶液等所用試劑均為分析純。豌豆蛋白購自煙臺雙塔食品股份有限公司，主要組成為水分4.62±0.02%，蛋白質73.2±0.23%，粗脂肪0.22±0.01%，灰分4.62±0.03%。

1.2 試驗儀器

單螺桿擠壓機由山東理工大學農業工程與食品科學學院研制。

1.3 豌豆蛋白的酶解

稱取一定質量的豌豆蛋白，加入一定質量的蛋白酶和一定pH值的磷酸鹽緩沖溶液，搖勻，置于恒溫振蕩水浴鍋中，酶解3 h，沸水浴滅酶10 min。冷卻后，將蛋白酶解液過濾，濾液，記為酶解物。

1.4 自由基清除活性響應曲面實驗設計

響應面法是利用多元二次回歸方程，來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過回歸方程尋求最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法。

1.5 酶解產物自由基O2.- 清除率活性研究

根據玄紅專等人的方法 ，加以調整。實驗組取0.3 mL的濾液加入試管中，準確移取5 mL Tris-HCl緩沖溶液（pH為8.2），于37℃恒溫水

空白組將濾液更換為蒸餾水，實驗步驟與上述相同。參比為5.3 mL的蒸餾水和0.3 mL的鄰苯三酚溶液。計算公式如下：

清除率=（ΔA0-ΔA）/ΔA0×100%

其中，ΔA0為空白組吸光度每分鐘的增值;ΔA為實驗組吸光度每分鐘的增值。

1.6 透析袋分離豌豆蛋白抗氧化肽

采用7、3.5、1 KDa的透析袋，對酶解液進行依次分離。預處理好的透析袋中加入約三分之二的酶解液，兩端封好，放在蒸餾水中進行攪拌，每隔一段時間換一次水，直至透出液不再有顏色變化，將透出液用旋轉蒸發儀濃縮，對濃縮液進行冷凍干燥，得到豌豆蛋白抗氧化肽粉。

1.7 豌豆蛋白抗氧化肽的抗氧化活性測定

對1.6中收集得到的分子量為小于1 KDa、1～3.5 KDa、1～3.5 KDa和大于7 KDa的豌豆蛋白抗氧化肽粉進行O2.- 清除率的測定。

1.8 豌豆蛋白酶解產物分子量分布的測定

用Waters Protein-Pak 125A 300 mm×7.8 mm色譜柱對經透析袋分離后得到的分子量小于1 KDa的組分進行分子量分布的分析。流動相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1（V/V），檢測波長：220 nm流速：0.5 mL/min柱溫：30℃。

1.9數據分析

每個操作3次平行。利用SAS 9.1軟件建立回歸模型方程，對數據進行Anova分析，Duncan test確定平均值差異。

2 結果與分析

2.1 響應面法優化酶解物O2.-清除活性實驗

在預實驗的基礎上，固定酶解時間3 h，選取加酶量（A）、溫度（B）、pH值（C）、底物濃度（D）為變量，以酶解物的自由基清除率活性為響應值，設計4因素5水平共26個試驗點的響應分析實驗進行二次回歸設計實驗和分析。實驗方案、實驗條件及結果列于表1表2中。

以O2.- 清除率為響應值，經回歸擬合后，木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白的O2.- 清除率的回歸方程為：O2.- 清除率=-1481+32.2*A+21.7*B+186*C+21.4*D-0.108*AB-1.06*AC+0.377*AD-0.440*BC+0.208*BD+0.394*CD-0.874*A2-0.156*B2-11.4*C2-2.76*D2。

注：-為不顯著（P>0.05），*為顯著（P<0.05），**為極顯著（P<0.01）。

由表3可知，所建模型是顯著的，失擬向是不顯著的，說明無失擬因子存在，該模型與真實測量值擬合良好。底物濃度、底物濃度的二次項、加酶量的二次項、溫度的二次項、pH的二次項影響極顯著。說明在木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白過程中，底物濃度、底物濃度的二次項、加酶量的二次項、溫度的二次項、pH的二次項對O2.- 清除率有顯著影響。由F值可知，F值越大對豌豆蛋白酶解度的影響就越大，所以各因素對豌豆蛋白酶解液O2.- 清除率的影響次序：底物濃度>酶解溫度>加酶量>pH。

2.2 最佳自由基清除率條件

以O2.- 清除率為評價指標，對回歸方程進行偏微分，得出最佳酶解條件：加酶量12.1%、溫度60.2℃、pH 6.46、底物濃度7.15%。在此條件下，得到最佳O2.- 清除率為64.0%。

2.3驗證實驗

經驗證，在此條件下，得到O2.- 清除率為65.3±0.22%。方差分析無顯著性差異。這說明該模型預測準確可靠，可用于豌豆蛋白酶解物.O2.-清除率效果預測及酶解條件確定和篩選。

2.4 豌豆蛋白抗氧化肽的分離

對用透析袋分離得到的四個不同分子量的組分肽進行抗氧化化性測定，測定結果見表3。

由表4可知，不同分子量的豌豆蛋白抗氧化肽均具有O2.- 的清除能力，其清除能力隨分子量減小而增大。分子量小于1 KDa的清除能力最強。這與文獻報道一致。因此后邊實驗以分子量小于1 KDa的組分為研究材料。

2.5?豌豆蛋白酶解物小于1 KDa組分的分子量分析

2.5.2?分子量小于1 KDa的酶解產物分子量分布圖

由圖1可知，經1 KDa透析袋分離后的酶解液，分子量大多集中在200～800 Da左右，說明酶解后得到的肽大多是2～8肽，這與相關報道結果一致。

3.結論

木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白最佳酶解條件：加酶量12.1%、溫度60.2℃、pH 6.46、底物濃度7.15%。此條件下，最佳O2.-清除率為64.0%。得到了豌豆蛋白木瓜蛋白酶酶解產物自由基清除預測模型，該模型預測準確可靠，可用于豌豆蛋白的生產預測和工藝開發。

參考文獻

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